一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染。
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 三. RT-qPCR具体实验步骤 引物设计: 除了遵循一...
利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线,因此只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 相对定量:检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异。如果对RNA模板的数量不能精确定量,或者只需要知道目的基因的表达差异时,可以使用相对定量法。 绝对定量:是用一系列已知浓度的标准品制作标准...
实验经验:猫大硕士毕业后曾在技术公司担任实验室主管,又经博士阶段系统科学训练,实验技能极为丰富全面。 快来抱紧猫大老师大腿,从入门到初级,再到中阶实验,统统都有详细教程,满足不同层次医学党的不同需求,更有超多实验方法和实验资源汇总,无论是小白还是大神,有了这套资源,实验技术都能更上一层楼! 课程君强烈...
提取RNA可用试剂盒,比如QIAGEN RNeasy Mini Kit ,按照说明书操作就行了,还可以利用TRlzol试剂提取,具体实验步骤参考:TRlzol法提取组织或细胞RNA。 关于RNA的提取,这里需要补充的是:将 RNA 反转录成 cDNA。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量,而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的...
1、 反应体系需要在超净工作台中通风配制;每次实验都要用新的ddH2O; 2、每次实验都需要配制NTC来验证体系中是否存在污染,配制体系时每一对引物都需要做NTC; 3、如果想检测RNA模板是否有gDNA残留,可将每个样本都配制NRT进行检测; 4、配制体系时,一个样本建议至少做3个技术型重复; ...
RNA提取是RT-qPCR实验成功的首要步骤,RNA的质量直接关乎RT-qPCR实验的结果。但是在实验过程中我们经常会碰到RNA提取实验翻车的情况,主要是因为RNA的分子结构不稳定和无处不在的RNase对RNA的降解造成的。 由此可见,想要提取到高质量的RNA并非易事。今天,小翌主要从样本选择、样本采集与保存、RNA提取这三个方面来阐述...
一步法RT-qPCR是常用的RNA分析方法之一。在一步RT-qPCR中,反转录酶和DNA聚合酶预混于同一管内,从而使得在单个反应中就可同时进行反转录和DNA扩增。相比于进行完反转录,准备试剂配制进行DNA扩增的两步法而言,一步RT-qPCR更加简单快速,移液步骤更少,污染...
让实验“价半”功倍 68 min快速RNA-RT-qPCR 20分钟--RNA提取 EasyFast快速RNA提取 目录号:DP451/DP452 ● 20分钟快速完成RNA提取 ● 无需额外添加疏基乙醇/DTT/氯仿 ● 30秒快速去除基因组 18分钟--反转录 FastKing cDNA第一链合成 目录号:KR118 ...
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR ）一、实验原理 逆转录 -聚合酶链反应 (Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA ，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo （dT ）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA ，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增，而获得目的...