RT-qPCR包括三大步骤:RNA的提取与质量检测、逆转录成cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验,可以合成cDNA探针、获取目的基因、以及分析基因的转录水平。 RNA的提取与质量检测 从细胞、组织等样本中提取出RNA后,需要对提取的RNA的纯度、浓度、以及完整性进行评估,质检达标后才能进...
定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中,总RNA或信使RNA(mRNA)首先通过逆转录酶转录成互补DNA(cDNA)。随后,以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中,其中包括基...
RT-qPCR包括三大步骤:RNA的提取与质量检测、逆转录成cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验,可以合成cDNA探针、获取目的基因、以及分析基因的转录水平。 RNA的提取与质量检测 从细胞、组织等样本中提取出RNA后,需要对提取的RNA的纯度、浓度、以及完整性进行评估,质检达标后才能进行后续的实验。一般需要通过紫外...
如若反复排除仍无法找到原因,建议将qPCR的产物作一次琼脂糖凝胶电泳,看是否在相应扩增条带上有显影(图 2.4,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题)。 图2.4 琼脂糖凝胶电泳验证产物 三、2^-ΔΔCT计算相对表达量 1、计算各组技术重复的均值 一般来说,跑qPCR的时候,每一个组要有三个生物学重复,每个重复需要有三...
图2. Yeasen （Cat#11899ES）与竞品T扩增能力对比使用Yeasen RT-qPCR全预混（Cat#11899ES）及竞品T品牌同时检测甲乙流（2000 拷贝/mL及200 拷贝/mL），结果表明：Yeasen（Cat#11899ES）相较竞品T品牌提前多个Ct值，更有优势。03出众的全预混稳定性 图3.Yeasen （Cat#11899ES）及竞品T品牌 4℃稳定性验证验证...
一、样本质量是 RT-qPCR 实验成功的关键因素之一 使用高纯度(不含 DNA 和蛋白质及抑制物)和高度完整(无降解)的 RNA进行实验是整个 RT-qPCR 实验流程中很关键的环节。降解或污染的 RNA 会产生低质量的 cDNA,从而导致 qPCR 反应效率低下,并导致不准确的低质量数据,具体表现为: ...
因此,cDNA浓度的测定值是不准确的,逆转录实验之后无需测定浓度。RT-qPCR是一个多步骤连贯实验,正是因为cDNA无法鉴定,只能通过后续qPCR实验才能呈现结果。 2 gDNA污染的识别与去除 gDNA的污染主要来源于RNA模板, 那如何识别RNA模板中是否仍含有gDNA残留呢?可以在逆转录之前将RNA模板进行琼脂糖凝胶电泳验证。如下图所示...
8. RT-qPCR 引物设计及验证是如何做好实验之PCR实验操作的第8集视频,该合集共计16集,视频收藏或关注UP主,及时了解更多相关视频内容。
(2)实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 实时荧光定量PCR,即第二代PCR技术,是指在整个扩增的过程中,引入了荧光染料或者荧光基团,随着DNA数量的成倍增加,反应体系中的荧光信号也会增强。 在整个PCR反应过程中,借助对荧光信号的强弱进行检测实时监测每一个循环中扩增产物量的变化,最后通过标准曲线和CT...