如果PCR反应存在非特异性扩增或污染,则可能会导致多个熔解峰或模糊的熔解峰(图2.3,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题),此时通常要重新设计引物。 图2.3 熔解曲线多峰 4)Tm值:一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上,若Tm<80℃,有可能出现引物二聚体。 如若反复排除仍无法找到原因,...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。 RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1反转录: 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 反转录过程中使用特定引物。 2 PCR扩增: 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。 PCR是...
(2) PCR 扩增：设置 PCR 扩增程序 (包含变性、退火、延伸、循环、彻底延伸)。(3) 检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。3 实时荧光定量 PCR (qPCR)实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 是 DNA 的实时 PCR 扩增，通过荧光探针测量，最常见的是插入染料或基于水解的探针，从而实现 PCR 产物的...
实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 实验步骤 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针,当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号,从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光标记方法分为两种：荧光染料嵌合法和荧光探针法。1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料，该染料在游离状态下几乎不会产生荧光，可以非特异地结合在双链DNA的...
在实时荧光定量PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。 RT-qPCR是由三个步骤组成:...
(2)可能原因:qPCR 预混液未混合均匀。 解决方案:使用前应充分混匀 qPCR 预混液(重复性较为理想的扩增曲线 STD<0.2)。 2.熔解曲线为非单一峰 (1)可能原因:非特异性扩增。 解决方案:根据设计原则设计新的引物,通过梯度 PCR 对引物退火温度进行优化。 (2)可能原因:出现引物二聚体,引物为非特异性引物。 解决...
RT-QPCR 基本原理和概念 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过在PCR反应体系中加入荧光染料(SYBR Green)或荧光标记的特异性的探针,与DNA产物特异性结合,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可...