RT-qPCR以RNA为起始材料,在RT阶段,运用逆转录酶以RNA为模板形成互补的DNA链(cDNA)。随后以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中,其中包括病原体检测、基因测试、疾病研究和基因表达分析。 1. RT-qPCR的一步法与两步法 1)一步法:将逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合...
RT-qPCR的原理主要包括RNA反转录、PCR扩增和荧光信号检测三个步骤。首先,RNA反转录将RNA转录为cDNA,即反转录过程。然后,PCR扩增通过DNA聚合酶酶链反应(PCR)使得目标DNA序列在体系中不断复制,从而形成指数级增长。最后,荧光信号检测通过荧光染料实时监测PCR过程中的DNA合成量,从而得到实时的扩增曲线。这三个步骤共同构成...
其原理主要包括三个方面:逆转录、PCR扩增和实时荧光定量检测。 1. 逆转录 rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA,这是通过逆转录酶(Reverse Transcriptase)催化的反应来实现的。逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA,为后续的PCR扩增提供模板。 2. PCR扩增 在cDNA合成完成后,接下来是PCR扩增反应。PCR扩增需要引物(...
其原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。 为了准确地进行基因表达量分析,必须满足只有cDNA 作为模板检出的先决条件,但 Total RNA 中常常混有基因组 DNA,并可以直接作为 PCR 反应的模板...
RT-qPCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点,因此在科研和临床中有着广泛的应用。 1. 基因表达分析,科研人员可以利用RT-qPCR技术对特定基因在不同组织、不同时间点或不同处理条件下的表达水平进行定量分析,从而揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。 2. 病原体检测,临床上常用RT-qPCR技术对病原体(...
RT-qPCR 对照 一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染...
RT-qPCR原理的三个主要步骤: 1 反转录: 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 反转录过程中使用特定引物。 2 PCR扩增: 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。 PCR是一个循环过程,呈指数级扩增DNA模板的数量。
核酸检测主要基于RT-qPCR技术,有一步法和两步法之分(详见图1)。针对COVID-19的核酸检测流程,简而言之,第一步是提取待检测样本的RNA(SARS-CoV-2的遗传物质是RNA),然后通过RT-qPCR检测是否含有SARS-CoV-2特异性序列。 图1. RT-qPCR技术原理 基于RT-qP...
实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后...