一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。 反转录过程中使用特定引物。 2 PCR扩增: 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。 PCR是一个循环过程,呈指数级扩增DNA模板的数量。 PCR反应中包含荧光染料或探针,它们结合到扩增的DNA序列上并发出荧光...
PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物...
TaqMan探针法则是应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物:依赖荧光能量共振传递(FRET)检测特异性扩增产物。TaqMan探针是一段长约18-24nt的核苷酸序列,它的5’端连接有一个荧光报告基团(F),3’端连接有一个淬灭基团(Q)。在非杂交状态下,荧光基团与淬灭基团距离较近,当受到照射时,荧光报告基...
SYBR实验步骤 Logo 1 RT-qPCR原理 定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法。1.荧光原理:SYBRGreen2.定量原理:(1)介绍三个概念:扩增曲线、荧光阈值、Ct值(2)定量原理:绝对...
基本步骤:(1) 准备反应体系:模板 DNA、引物 (正、反向)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反应缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、耐高温 Taq DNA 聚合酶、去离子水等。也可直接使用 PCR Mix。(2) PCR 扩增:设置 PCR 扩增程序 (包含变性、退火、延伸、循环、彻底延伸)。(3) 检测:通过琼脂糖...
4. PCR扩增(扩增检测区) 4.1将反应管放入仪器样品槽内。 (一切准备就绪后,接下来就是真正的PCR的扩增反应步骤了,以下例举了三台配套的仪器进行实时荧光定量PCR的参数设置及操作步骤,就像核酸提取试剂盒、PCR反应试剂盒有不同厂家不同品牌一样,进行实时荧光定量...
RT-qPCR技术的原理介绍 定义和背景知识 RT-qPCR技术是一种用于检测和定量分析RNA的方法,并广泛应用于分子生物学研究和临床诊断。反转录过程的原理及作用 反转录过程将RNA转录为相应的DNA,这一步骤是RT-qPCR技术的关键,为后续PCR反应提供了必要的基础。实时荧光定量PCR过程的原理和步骤 在实时荧光定量PCR中,通过...
经过变性、退火和延伸重复若干个循环后,就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 图2 PCR的基本原理 图3 PCR的流程步骤 三、PCR的分类 1.普通 PCR 普通PCR即第一代PCR,普通PCR扩增仪即可扩增靶基因,并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。 2.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)...