答:如果不能将细胞分散成单个细胞悬液的话是无法用流式细胞法分析的;检测时最少要有 2000 个细胞,但最初准备样品时,如果只做外标,样品比最少细胞数大一个数量级即可;但要是需要作内标的话,固定液和穿膜液粘度大,细胞损失也多,而且,穿膜液一般对细...
单层培养细胞:单层贴壁细胞的收集 (收集细胞数量请不要超过 1×10⁷ ) :可直接在培养容器中裂解 (容器体积不超过 10 cm³) , 或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法) 。 细胞和细菌悬液:离心取细胞。每 5×10⁶ - 1 × 10⁷ 细胞加入1...
取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON®Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增20个不同GC含量(25-65%)、不同表达丰度的基因。 ◎线性检测范围广,Total RNA 10pg-5μg 图6.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使...
(最好是500,要是没有刚好覆盖就可以,200μL也勉强可以,也不需要太多,直接在细胞上加入trizol是我比较喜欢的方式。) 每10cm2(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。trizol加量不足可导致提取的RNA有DNA污染。 组织:每50-100mg组织加入1ml trizol...
如果呈指数增长型,可能是cDNA浓度过低,可适当增加cDNA浓度。再看溶解曲线,溶解曲线应该只有一个峰值,而且峰值的位置是在Tm附近,距离Tm较远,或存在多个峰值则需要重新设计引物。最后,如果怀疑仪器传感器问题,可以将QPCR产物做琼脂电泳,如果引物能扩增片段,会在80-250bp附近出现一个条带。
简单、有效的Cell Direct RT技术,只需7min即可得到RNA样本。 样品需求量小,最少10个培养细胞即可进行实验。 高通量,可以快速对384、96、24、12、6 孔板等培养细胞进行RNA检测。 DNA Eraser能够快速去除释放的基因组,大大降低对后续实验结果的影响。 优化的RT及qPCR体系,使两步法RT-PCR具有更高效的逆转录和PCR特...
在反转录反应中,TB Green qPCR 法的 RT Primer Mix 用量为 1 μl, 探针 qPCR分析法的用量为 4 μl。 得到的RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中,其加入量不要超过Real Time PCR 反应体积的 1/10(V/V)量。 Real Time PCR : ...
在IVD领域的应用：1、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）2、cDNA文库构建 3、RNA测序 4、RT-qPCR，2019新冠核酸检测所配置的体系试剂当中，必然会加入逆转录酶。因为RNA病毒必须逆转录为DNA，才能进行PCR反应。M-MLV逆转录酶 DNA聚合酶 定义：它是以DNA为模板，从DNA5'端复制到3'端，催化底物dNTP分子聚合形成子代...
RT-qPCR是一种对特定DNA进行定量分析的方法，其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行荧光定量PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性...