RT-qPCR反应由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百...
从RNA提取到qPCR 高品质RNA模板制备 RNA作为DNA的转录产物,包括组成型RNA、表达型RNA和调节型RNA。RNA参与生物机体的重要生命活动,也是一直以来的研究热点,如:疾病相关基因转录组或表达谱的研究及科学研究相关基因的表达水… 全式金生物 RNA-seq中的那些统计学问题(一)为什么是负二项分布? Understorm-Lianm 注册申...
microRNA(miRNA)是一类长度在 22nt 左右的小 RNA 分子,它并不编码 蛋白质,因此 miRNA 与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样,也是一种非编 码 RNA。 6miRNA QPCR 检测 在做qPCR的过程中,常常会出现各种问题,让初学者一筹莫展,要debug,首先要明白bug是怎么出现的,才能对症下药。 7流式检测细胞周期 PI法...
取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON®Power qPCR预混液(Cat .11195ES)扩增20个不同GC含量(25-65%)、不同表达丰度的基因。 ◎线性检测范围广,Total RNA 10pg-5μg 图6.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat .11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff ...
通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:逆转录酶,你真的了解吗?》一文的学习,相信大家对逆转录酶有了一定的了解,但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成,逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的,逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来,小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关知...
普通PCR是将的得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过核酸染料染色并借助紫外凝胶成像仪进行观察,最后通过终产物进行定性或者半定量分析;qPCR是在反应体系中引入荧光基团(染料或者探针),进而对qPCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应的过程,结合相应的qPCR仪自带软件可对产物进行分析,并计算出待测样品模板的初始浓度。 图1...
对于qPCR来说,有以下几点经验和大家分享: 1.加样需要仔细,勿加错 大家可能有过这样的经历,好不容易做完逆转录,结果加样的时候由于各种原因还是出现了加错样的事件。 2.引物设计时,应遵循适当的原则 在使用 SYBR 染料法时,引物设计需遵循以下原则:引物长度 18～25bp,产物长度 80～300bp,GC 含量 40～60%,避...
荧光定量PCR是一类高灵敏的实验,要求实验人员操作高度精细化。因此,在进行qPCR实验过程中,我们总是不可避免的会遇到问题:一、 非实验因素的相关问题。二、 受实验因素限制的问题
qPCR、Real-time-PCR? 其实Rea-ltime-PCR和 qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR )是一码事,都是实时定量 PCR,指的是 PCR 过程中每个循环都有数据的实时记录,因此可以对起始模板数量进行精确的分析。 虽然Real-time PCR( 实时荧光定量PCR)和...
real time RT-PCR 指的是 qPCR+RT-PCR 的组合,是说将 mRNA 逆转录为 cDNA 后再作为模板进行实时荧光 PCR 分析,因为 RT-PCR 是可以定性的,但不能进行定量检测的。 所以不难理解 real-time RT-PCR(RT-qPCR) 就是结合了荧光定量...