①微量分光光度计检测RNA浓度。先用稀释用的TE buffer将分光光度计调零，然后取少量RNA溶液用TE稀释后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的OD值。OD260下读值为1表示40 ng RNA/ml，样品RNA浓度（g/ml）计算公式为：OD260×稀释倍数×40 ng/ml。OD260/OD280的比值在1.8~2.0的范围内为佳。②变性琼脂糖...
25×One Step RT-qPCR RTase mix 5×One Step RT-qPCR Buffer 10×Enhancer 试剂原理：TaqMan One Step RT-qPCR kit首先利用反转录酶RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板通过热启动DNA扩增酶在单管闭管反应体系中连续进行PCR扩增反应，利用荧光标记探针（Probe）水解发光，并对发光信号进行检测。 1. RT-PCR...
PCR反应体系主要包含以下五种成分：模板（template)、引物（primers)、底物(dNTP)、DNA聚合酶、PCR缓冲液(PCR buffer)。总结 PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测；qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的...
迈迪安提供专门的RT-qPCR Buffer (MDX034),含有优化的离子和dNTP浓度,能够大大简化研发优化的时间。 04 gDNA去除 RNA中存在基因组DNA(gDNA)污染可能会引起qPCR反应中出现假阳性,导致结果的不准确,所以逆转录实验中gDNA的去除也是至关重要。通常在RNA提取过程中...
Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中,逆转录和定量PCR在同一反应管中进行,简化了实验操作,降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板,使用基因特异性引物,利用耐热Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA,并搭配使用探针和UNICON® HotStart...
【化学修饰RT-qPCR检验步骤】 以SLAN-96P 为例 1. 在 RNase-free 离心管中配制反应混合液: 组分 体积(μL) 2× Reaction Buffer 1 12.5 RT-qPCR Enzyme Mix CMM 1 Foward Primer(10μM) 0.5 Reverse Primer(10μM) 0.5 Probe(10μM) 0.25 ...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
1 定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR ）一、实验原理 逆转录 -聚合酶链反应 (Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA ，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo （dT ）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA ，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增，而获得...
RT-qPCR 步骤---SYBR Green法 反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不 易检测 2. Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准 3. MgCl2(多聚酶的激活剂)浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产 物 4. 反应Buffer体系的优化 5. 反应温度和时间参数...
RT-qPCR由普通PCR技术发展而来,它是在传统PCR反应体系中加入荧光化学物质(荧光染料或者荧光探针),根据各自不同的发光机制实时检测PCR退火、延伸过程中荧光信号变化来计算PCR每个循环中产物的变化量,目前最常见的方法为荧光染料法和探针法。 荧光染料法:一些荧光染料如SYBR Green Ⅰ,PicoGreen,BEBO等,它们本身不发光,但...