SYBR Green I 法进行检测时,可根据熔解曲线确认PCR产物的特异性。曲线横坐标是温度,纵坐标是荧光强度的变化值(不是强度本身)。其原理是依据温度从60度升至90度时,荧光强度的变化值。当温度达到PCR产物的Tm(双链DNA分子解链一半时的温度)时,荧光强度变化最大(峰值)。 6绝对定量分析方法 绝对定量中,LOG(
RT-PCR技术中主要的曲线有下面三种:1.扩增曲线 随着实验的进行,扩增产物不断累积,相应的荧光信号也不断在增加,每进行一个循环就采集一次荧光的信号,经过一定的循环数后(比如40个循环),就可以得到下面的扩增曲线图(横坐标代表扩增的循环数cycle,纵坐标代表荧光的强度)。 这其中还需要弄清楚一些基本概念,如: 基线:...
Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，因此只要获得...
SYBR Green I 法进行检测时,可根据熔解曲线确认PCR产物的特异性。曲线横坐标是温度,纵坐标是荧光强度的变化值(不是强度本身)。其原理是依据温度从60度升至90度时,荧光强度的变化值。当温度达到PCR产物的Tm(双链DNA分子解链一半时的温度)时,荧光强度变化最大(峰值)。 6 绝对定量分析方法 绝对定量中,LOG(起始浓...
实时荧光定量PCR(RT PCR)标准品是自己制备的所以浓度已知用标准品去进行pcr扩增在电脑上会出现一荧光扩增曲线荧光扩增曲线的横坐标是ct值纵坐标是荧光信号的积累量不同浓度的标准品可根据图读出它的ct值比如下图中绿色的线是标准品的话ct值就是和荧光阈值交点所对应的横坐标由此可以根据标准品的ct值和浓度做出一条...
SYBR Green I 法进行检测时,可根据熔解曲线确认PCR产物的特异性。曲线横坐标是温度,纵坐标是荧光强度的变化值(不是强度本身)。其原理是依据温度从60度升至90度时,荧光强度的变化值。当温度达到PCR产物的Tm(双链DNA分子解链一半时的温度)时,荧光强度变化最大(峰值)。
纵坐标:荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集 荧光信号阈值:前15个循环信号作为荧光本地信号baseline,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 Ct:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。定量时多取15-...
Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数
各模板的CT值和该模板最初拷贝数的对数呈线性关系,最初拷贝数越大,CT值越小。 标准品以一定倍数稀释至5-6个浓度左右,根据RT-PCR的反应条件进行反应。 以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以CT值为纵坐标,绘制直线曲线。 未知样本的拷贝数可以根据曲线方程计算。
- 对这些标准品进行RT - PCR反应,得到各自的CT值。然后以标准品的浓度为横坐标,CT值为纵坐标绘制标准曲线。通常情况下,标准曲线应该是一条直线(在理想状态下)。如果这条曲线弯曲得很厉害,那就可能是实验过程中出现了问题,比如加样不准确或者反应体系有抑制物等。 - 标准曲线的斜率和截距都有重要意义。斜率反映...