一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...
如果是目的基因和内参基因的扩增效率相差比较大,可以用扩增效率进行校正,也就是Pfaffl方法。所用公式如下: 处理所致倍数变化(fold change)= C(A-E)/D(F-B) 扩增效率(E)=10-1/斜率(理想的PCR扩增效率=2) 百分比表示为:e%=(E-1)×100% 同时是上面例子,如果Cdk5的扩增效率是70%;GAPDH的扩增效率是95%,那...
计算出ratio后,很多人就拿它来做t检验。这种做法是不对的,因为ratio的分布明显是右偏的。从理论上看,PCR的扩增可以分成以下三个阶段,指数扩增、线性扩增、平台期。 当试剂量足够的时候,就处于指数扩增阶段,只有当PCR试剂不足时,才进入线性扩增期,最后当试剂被耗尽时,产物不增长,位于平台期。 在我们的实验中,通...
荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法,他的计算方法有很多,常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法,ΔCt法,2-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的2-ΔΔCt法(Livak法): qRT-PCR介绍及计算公式 该部分引用自下方参考链接1 qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增,在PCR扩增过程中,通过收集荧光信号,对PCR进程...
youtube【科普教程】RT-qPCR(实时荧光定量PCR)的数据计算(上), 视频播放量 1439、弹幕量 0、点赞数 10、投硬币枚数 0、收藏人数 22、转发人数 0, 视频作者 朱墨老师, 作者简介 大学副教授,硕士生导师,相关视频:【基因家族分析教程视频】1.数据准备,【基因家族分析教
qPCR-定量PCR-Graphpad 作图教程-数据作图 计算步骤: 一般一种处理即需要一个内参,同一个处理的多个基因可以共用一个内参。 内参Ct计算均值(可选); 目的基因 - 内参均值 = dCt;(可以按replicate相减,不用均值) 处理- 对照 = ddCt; Log2FC = -ddCt; ...
如果按500bp计算,延伸时间就是500/1000*60s=30s。终止延伸时间的设置,一般设置5min即可。PCR产物检测:琼脂糖凝胶电泳注意:电泳槽里装的电泳液是1X TAE溶液;琼脂糖凝胶泡在电泳液里,凝胶是带点样孔的,样品就点在这种点样孔里;电泳槽的一边接电源负极,另一边接电源正极,RNA或DNA带负电,会从负极跑向正极;电泳...
1. PCR仪 2. PCR管 3. 微量移液器 【操作方法】 一、逆转录 1)逆转录RT反应体系构成: 2)涡旋混匀,42℃反应1小时,95℃加热5分钟,然后置于冰上。 二、PCR扩增 1) PCR反应体系构成 2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环 Step2-4运行30个循环,其中复性温度主要依据引物的不同而不同。