优化RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的灵敏度与特异性这一精密过程中，我们需采取一系列细致入微的策略，确保每一步骤都精准无误。1、 确定模板 RNA 完整性好。无 DNA 污染。确保模板RNA的完整性犹如守护生命之源的纯净，这不仅要求RNA无降解迹象，更需严格排查DNA污染的隐患，以免假阳性结果如同幽灵般潜入实验，...
为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中,那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%,这不足以抑制PCR。 5. RNaseH处理: 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度...
增加RT-PCR灵敏度 分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高...
数字PCR即三代PCR，是对原始PCR的另一种改进，是一种能够实现核酸绝对定量的精准检测技术，基于泊松分布原理将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝对计数，提高检测灵敏度和准确度。4. 逆...
在做数据处理之前,需要先评估实时定量PCR反应的质量如何。 1、灵敏度 涉及到灵敏度问题,可能大家首先会想到扩增酶的灵敏度,诚然扩增酶灵敏度是一个关键性因素,但是对于低拷贝的模板量,又不能按普通情况来预期。不管是高拷贝模板还是低拷贝模板,都会遵循泊松分布,即进行平行重复时,...
RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力,尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比,SuperScripⅡ显著提高了长 RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性,所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下...
问:如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性? 答: 确定模板RNA 完整性,无DNA污染; RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂; 为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin; 使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱; 若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩...
RT-PCR的基本步骤包括:首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝,接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容,所以这两个步骤(RT 和PCR)通常分别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤合而为一,但是同样因为上述的缓冲液不兼容性,极大地限制了检测灵敏度。Eppendorf 设计了一个含有全新化学...
在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度，而且对于小量RNA，减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。7、减少基因组DNA污染：RT-PCR所遇到的一...
Q2:RT-PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物,怎么处理?点击下方查看👇 丁香实验,,, 点击查看解决办法 小程序 Q3:RT-PCR 特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 可能原因: 1)物和模板非特异性退火 建议解决方法:在第一链合成中使用 G...