污染和假阳性问题:RT-PCR实验过程中,由于操作复杂且涉及多个步骤,容易引入污染,如DNA污染、RNA酶污染等。这些污染可能导致假阳性结果的出现,影响实验的准确性和可靠性。此外,如果引物设计不当或反应条件控制不严,也可能导致非特异性扩增,进一步增加假阳性的风险。 灵敏度与特异性的平衡:虽然RT-PCR具有高灵敏度的特点...
当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成...
首先,有基础性的PCR分类,包括普通PCR、逆转录PCR和荧光定量PCR。普通PCR用于扩增DNA片段,逆转录PCR用于从RNA转录成DNA,而荧光定量PCR可以用来准确测量DNA或RNA的浓度。其次,还有特定领域中常用的PCR分类,如实时荧光PCR、多重PCR和数字PCR。实时荧光PCR可以实时监测PCR反应的进行,多重PCR可以同时扩增多个目标序列,而数字...
由于这种检测方式具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性,数字 PCR迅速得到广泛的关注,尤其在痕量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测、核酸拷贝数变异和基因表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可。 优点:实现绝对定量,更高的敏感性和特异性,可以检测低拷贝样品 缺点:仪器设备和试剂昂贵,操作复杂...
优点：1.中间产物 cDNA 能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库;2. 通过oligo dT和随机引物，可以从单个RNA样本中扩增多个靶标，而不需要多重cDNA库;3. 方便对下游条件优化调整，灵活性强;4. 试验成本低。缺点：1. 更多的移液步骤会增加DNA污染的风险，并且耗时;2. 相较于一步法，需要进行更多的...
两步法的缺点是由于更频繁的样品处理而容易受到污染。 另一方面,从 cDNA 合成到 PCR 扩增的整个反应在一步法中发生在一个试管中。一步法被认为通过在单一环境中包含所有酶促反应来最小化实验变化。它消除了将劳动密集型且容易污染的 cDNA 产物移液到 PCR 反应的步骤。进一步使用耐受抑制剂的聚合酶、聚合酶增强剂...
RT-PCR(real-timepcr)在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点RT-PCR(real-timepcr)在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点病情描述:做视网膜中bcl-2和bax两个因子用TR-PCR和其它的方法比如免疫组化相比有何优缺点,多说一点优点。专家意见:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相...
缺点: 1. 无法分别对两步反应进行优化; 2. 由于反应条件是结合两步反应折中得到的,因此灵敏性不如两步法; 3. 单一样品检测的靶点数较少。 两步法 优点: 1.能够建立可以长期保存,并用于多次反应的稳定的cDNA库; 2. 靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行...
然而,实时定量RT-PCR也存在一些优缺点以及面临的挑战。 高灵敏度:实时定量RT-PCR能够在非常低的RNA浓度下进行检测,这使得该技术成为检测微量RNA样本的理想选择。 高特异性:通过设计特异性引物和探针,实时定量RT-PCR能够准确识别目标RNA序列,避免了非特异性扩增和交叉反应。 高精确性:实时定量RT-PCR能够准确地测量RNA...