实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)是一种结合逆转录与实时荧光定量PCR的技术,用于RNA的定量分析。其核心是通过逆转录将RN
实时定量PCR(RT-qPCR)实验操作流程 一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,...
RT-qPCR 对照 一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染。
4)Tm值:一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上,若Tm<80℃,有可能出现引物二聚体。 如若反复排除仍无法找到原因,建议将qPCR的产物作一次琼脂糖凝胶电泳,看是否在相应扩增条带上有显影(图 2.4,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题)。
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光标记方法分为两种：荧光染料嵌合法和荧光探针法。1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料，该染料在游离状态下几乎不会产生荧光，可以非特异地结合在双链DNA的...
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆...
实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测的能力(即实时)。因此,数据可在PCR扩增过程中,而非PCR结束之后,进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,而非在一定循环数后...
● RT-qPCR(Reverse Transcription Quantitative real-time PCR)：这是一种将RT-PCR与qPCR相结合的技术，用于反转录定量实时PCR。通过在qPCR反应中使用cDNA来测量RNA水平，从而快速检测基因表达的变化。RT-qPCR可用于研究用抑制剂、刺激剂、小干扰RNA(siRNA)或基因敲除模型等处理模型系统时基因表达的变化。这项技术还...
逆转录实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是一种结合了逆转录PCR和实时荧光定量PCR的技术,可以对RNA分子进行定量分析。RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA,然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究,如基因表达分析、病毒载量检测等。 RNA的荧光定量PCR引物要求与普通qPCR相同,...