表1.DNA结合染料法和TaqMan探针法对比 二、实验步骤 图5.RT-qPCR实验步骤示意图,图片来源:bing.com 1.设计引物 RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物,引物设计的好坏,关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否,所以引物设计是实验成功的第一步。引物设计有以下几个原则:(1) 引物最好跨内含子设计(...
而进行除此之外的RT-qPCR实验,都可以使用荧光染料法。 表1.DNA结合染料法和TaqMan探针法对比 二、实验步骤 图5.RT-qPCR实验步骤示意图,图片来源:http://bing.com 1.设计引物 RT-qPCR的第一步是对靶基因设计特异性的引物,引物设计的好坏,关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否,所以引物设计是实验成功的第一...
RT-qPCR 对照 一个逆转录阴性对照(-RT对照)应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中,以检测 DNA 污染(如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物)。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录,因此如果观察到 PCR 扩增,则极有可能来自 DNA 的污染。
定量反转录聚合酶链式反应,也称为 RT-qPCR ,用于检测和定量 RNA。 总 RNA 或 mRNA 首先转录成互补 DNA (cDNA)。随后使用 cDNA 作为定量 PCR 或实时 PCR 反应 (qPCR) 的模板。在 qPCR 中,在每个 PCR 循环中使用荧光测量扩增产物的量。RT-qPCR 用于多种...
4)Tm值:一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上,若Tm<80℃,有可能出现引物二聚体。 如若反复排除仍无法找到原因,建议将qPCR的产物作一次琼脂糖凝胶电泳,看是否在相应扩增条带上有显影(图 2.4,来源:QPCR-如何判断引物设计是否有问题)。
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合,其中的“RT”是Reverse tranion(逆转录)的意思,所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性,但不能进行定量分析。
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合,其中的“RT”是Reverse transcription(逆转录)的意思,所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性,但不能进行定量分析。与RT-PCR一样,RT-qPCR...
一. RT-qPCR 基本原理和概念实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 以cDNA 为模板进行 PCR,在 PCR 扩增过程中,通过收集荧光信号,对 PCR进程进行实时...