一、RNAi实验原理 RNA干扰(RNAi)通过引入小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)靶向降解特定mRNA,抑制目标基因的蛋白表达。本实验以哺乳动物细胞中siRNA转染为例。 二、实验前准备 1. 试剂与材料 siRNA:靶基因特异性siRNA(设计或购买已验证的序列)+ 阴性对照siRNA(非靶向序列)。 细胞:目标细胞系(如HEK293、HeLa等...
由于实验环境中 RNA 酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受 RNA 酶污染非常重要。 5. 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性。通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用 50 代以下的转...
转染siRNA是RNAi实验的另一个重要步骤。转染siRNA可以通过多种方式进行,如化学转染、电穿孔、病毒载体等。其中,化学转染是最常用的方法之一,可以使用多种转染试剂,如Lipofectamine、RNAiMAX等。在转染siRNA之前,需要确定最佳的转染条件,包括转染试剂的浓度、转染时间、细胞密度等。 4.检测RNAi效果 检测RNAi效果是RNAi实验的...
在进行rnai实验之前,我们需要设计合适的RNAsiRNA序列,这些序列将会与目标基因的mRNA相结合并导致其沉默。为了设计合适的siRNA序列,需要考虑以下几个因素: - 目标基因的序列和结构:需要选择与目标基因序列特异性互补的siRNA序列。 - siRNA序列的长度:一般选择长度为21-23个核苷酸的siRNA序列。 - siRNA序列的化学修饰:可以...
方法与步骤 悬浮细胞的电穿孔法 1. 电穿孔进行基因转移 使用电穿孔将多种不同类型的分子载入活细胞中。操作步骤包括细胞生长、洗液、计数、DNA混合、电穿孔装置设置、电处理、转移至培养容器、培养，以及测定基因表达量。检测电穿孔效率和细胞存活率 通过罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞，洗涤细胞、电穿孔、...
加入RNAi max,vortex,不离心,静置20min。 7. 准备六孔板细胞:吸掉原培液,加入800ul新培液。 8. 将以上混合液加入六孔板中。 9. 24h后换液,加入2ml 新培液。 10. 再过24h后,先看荧光,若实验组相比对照组荧光减弱,说明RNAi有效果; 11. 收样:加入500ul 1X SDS loading; ...
RNAi 原理及实验步骤 RNAi:理论与试验操作 激光生命科学研究所 Xi-Chao Wang, December, 2006 目 录Ⅰ. RNAi 简介 Ⅱ. siRNA 设计 Ⅲ. siRNA 对照 Ⅳ. siRNA 转染 Ⅴ. mRNA 水平RNAi效果监测 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测 Ⅶ. 常见问题解答(FAQ) Ⅰ. RNAi 简介 RNAi的发现: 1990 年,Jorgensen 及Mol ...
如果实验对象是哺乳动物细胞,使用培养细胞时需要确定以下两点: 使用的 siRNA 是否能有 RNAi 干扰效果/目标的序列是否有效序列 n 目的基因是否容易敲除 3.1.1 合成的 siRNA 直接用合成的 siRNA, 属于瞬时转染。 可直接购买市售商品或定制合成的 siRNA。 对照siRNA:Cosmo 对照 siRNA、Wako 对照 siRNA 3.1.2 质粒...
RNAI实验步骤案例RNAI实验步骤案例 1、RNAI技术简介 RNAi(RNA interference,即RNA干涉)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的[1]。RNAi现象首先是...