目前大多数发表的 RNA-seq 数据都是基于 oligo-dT 方法富集包含 poly(A)尾巴的转录本,但是这种方法除了会导致 3ʹ端偏好外,很多不含 Poly-A 尾巴的非编码 RNA,例如 miRNA 和增强子 RNA 不会被测到。短链非编码 RNAs(如 miRNA)既无法用 oligo-dT 方法富集,因此对其研究需要特定的分离建库方法,一般是切胶或...
通过PCR扩增完纯化后,进行文库质检,质检完的文库就成了标准的测序文库。 注意,不同样品的total RNA中mRNA含量差异较大,若total RNA起始投入量过低,不能保证有足够的mRNA用于后续建库,因此建议RNA起始量为1～4μg。 在建库的时候会对mRNA的完整度有较高的要求。只有在完整度高的mRNA中测序才会产生比较好的测序结果。
1. RNA样品检测 采用分子生物学先进设备检测RNA样品的纯度、浓度和完整性,以保障使用合格的样品进行转录组测序。 2.RNA文库构建 样品检测合格后,进行文库构建,主要流程如下: (1) 用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA; (2) 加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断; (3) 以mRNA为模板,用六碱基随机引物(ran...
介绍Watchmaker 公司的低起始量、低质量 RNA 样本的 RNA-seq 测序建库试剂盒。 这个试剂盒通过优化酶、接头、操作流程等一系列改进,做到了能够对低起始量、低质量 RNA 样本(包括从 FFPE 石蜡样本中回收的 RNA)进行RNA-seq 测序建库的目的。并且能够得到良好的测序结果。 字幕内容 今天我要给大家介绍 watchmaker 公...
rna-seq建库原理 总RNA提取。 从生物样本(如细胞、组织等)中提取出总RNA,这一步通常使用 TRIzol试剂等方法,利用其能够裂解细胞并使RNA与蛋白质等其他生物大分子分离的特性,经过氯仿抽提、异丙醇沉淀等步骤,最终得到纯度较高的总RNA。 mRNA富集或rRNA去除。 mRNA富集:真核生物的mRNA在其3'端具有多聚腺苷酸(poly(...
如何构建链特异性文库 目前链特异性文库的建库方法有很多种，主要分为2类。第一类是在RNA的3’和5’端加上不同的接头，2个不同的接头序列标记RNA的3’和5’端（图1A）。第二类依赖于化学修饰标记一条链，使得碱基发生变化或链被降解（图1B）。不同RNA样本如何构建链特异性文库 1 小RNA属于非编码核糖核酸（...
链特异性转录组测序(strand-specific RNA-seq)是指转录组测序过程中文库构建采用的链特异性建库方式。此建库方式可以保留转录组测序时转录本的方向信息,即可以确定转录本是来源于基因组上面的正义链还是反义链。 写在最后:有时间我们会努力更新的。大家互动交流可以前去论坛,地址在下面,复制去浏览器即可访问,弥补下公...
本文将简单介绍RNA-Seq建库策略--Smart-seq2的基本原理 smart-seq2流程.png 1.收集细胞 将细胞处理后(胚胎需去除透明带),置于含有RNA酶抑制剂的细胞裂解中,如果不立即进行实验需置于-80℃保存。(细胞处理过程尽量小于30min,避免细胞状态改变) 2.反转录为cDNA(此方法的独特之处,具体细节请看原文) ...
近期Oxford Nanopore展示他们的纳米孔测序技术能直接测序RNA,也就是说,建库过程中没有修复、cDNA合成、PCR扩增这些过程,移除了这些操作过程的偏好并且保留了RNA上的表观修饰信息,这一技术也称为dRNA-seq。直接从RNA建库需要两步接头连接。首先,带有oligo(dT)悬臂的duplex adaptor与mRNA的PolyA尾巴退火连接。后续是一个...
有哪些常见的RNA-seq建库技术?各有什么特点 two commonly used RNA-seq library preparation protocols: poly-A-tailed mRNA selection (PA) ribo-depletion (RD) PA showed better performance in the expression-based classification PA protocol better represented total RNA compared to the RD protocol. ...