最后需要确定的测序参数包括reads长度以及是生成单端还是双端reads。 在许多测序应用中,测序reads的长度对数据可用性有很大影响,更长的测序reads可以覆盖更多的测序DNA。当使用RNA-seq鉴定DGE时,影响数据的可用性的重要因素是确定每个reads来自转录组中哪个基因的能力。一旦可以明确地确定reads位置,测序更长的reads在基于定...
平台间的差别会改变产生的reads长度、reads质量,以及每次运行测序的总reads数目和测序文库所需的时间。不同的平台都使用不同的流动池(flow cell),流动池是一个覆盖有与你的模板分子中添加的接头成对互补的寡核苷酸的玻璃表面。流动池是测序反应发生的地方。 (4)测序仪流动池结构:测序仪一次运行(Run)可以使用2个流...
Total Reads Mapped:在样本中映射到参考基因组的总reads数,通常以百万为单位,即106。 RPKM与FPKM类似,两者计算方法相同, 区别在于FPKM针对双端测序。其中103是用来标准化基因的长度,106用来标准化测序深度。FPKM排除了测序深度对总reads数的影响,但是没有考虑到基因转录本长度对reads总和的影响,所以就有了TPM。 TPM:...
RPM (Reads per million mapped reads) RPM方法:10^6标准化了测序深度的影响,但没有考虑转录本的长度的影响。 RPM适合于产生的read读数不受基因长度影响的测序方法,比如miRNA-seq测序,miRNA的长度一般在20-24个碱基之间。 RPKM/FPKM (Reads/Fragments per kilo base per million mapped reads) RPKM/FPKM方法:10...
CPM:Counts per million (CPM) mapped reads,只对测序文库(每个样本总reads数)标准化,而不对长度标准化。这是因为,差异分析往往是同一基因在两组或多组样本量的差异,因此不必在计算单位长度基因的表达量。 RNA表达量差异分析(火山图、聚类分析图、GO分析、KEGG分析) ...
使用Illumina技术检测的short reads来发现新的转录本是RNA-seq分析中的一个挑战。通常来说,短reads很少会跨越多个剪切位点,这就很难直接推断出一个转录本的整体长度。 此外,转录的起始和终止位置也比较难识别,一些像GRIT的工具,通过合并5'端的信息可以提高异构体识别的准确性。其他如Cufflinks、iReckon、SLIDE和StringT...
该部分包含测序基本信息,例如测序平台信息、测序reads总数以及测序reads长度; Per base sequence quality 该部分包含测序单碱基质量信息,横坐标为碱基,纵坐标为测序质量,测序质量的计算方式为-10*log10(error rate),可以根据颜色简单判断测序质量,从红色到绿色区间,测序质量逐渐变高。另外,由于每个碱基位置的质量是由很多...
reads长度的分布 理论上每次测序仪测出的read长度时一致的,但是由于建库等因素通常会导致一些小片段,reads长度不一致时报"WARN";当有长度为0的read时报“FAIL 10.png Sequence Duplication Levels 统计序列完全一致的reads的频率,横坐标是duplication的次数,纵坐标是duplicated reads的数目,以unique reads的总数作为100%。
由于测序集中在转录本的3ʹ末端,因此需要的读长(reads)更少,这就降低了成本,并且一次测序的样本数目也可以更多。富集的3ʹ末端也可以用于确定单个转录本的poly(A)位点,而由于mRNA前体上存在的APA,其3‘末端可能会发生变化。(群主批注:目前单细胞转录组商业王者10X就是采用这种方法,仅仅是对3ʹ末端测序)...
1.1 RPKM(Reads Per Kilobase Million) 字面理解:RPKM(Reads Per Kilobase Million)的分子是reads计数,分母是Kilobase和Million。故需要除以Kilobase和Million,reads对应的是RNA-seq中,某基因匹配到的reads计数,Kilobase对应的是基因的长度,而Million对应的是测序深度...