首先我们要知道RNA-seq的数据为什么要标准化,RNA-seq要解决的一个关键问题就在于定量,像qPCR一样,这样不同样本才能比较,而这些标准化的方法主要想解决两个问题: 我们一个个介绍: FPKM的计算公式如图 其中C是比对到该基因的外显子上的片断数,N是所有map至基因组的reads的碱基数,L就是该基因外显子碱基全长。 ...
(a)左图显示了在一个大的RNA-seq数据集中对3个基因未归一化表达与对数测序深度估计回归,不包含零测量值,低、中、高表达定义分别为非零未归一化测量的第10至第20分位数的中位数表达(蓝色),第40至50分位数(黑色)和第80至90分位数(红色)。...
CPM对RNA-seq数据进行了测序深度的标准化,但没有考虑基因长度。因此,尽管它是一种样本内标准化方法,但CPM标准化不适用于对基因表达进行样本内比较。 RPKM/FPKM FPKM(每百万片段的转录本千碱基数)适用于双端(配对)数据,而RPKM(每百万读数的转录本千碱基数)适用于单端数据,它们校正了文库大小和基因长度的变化。一般...
下一步是标准化计数数据,以便能够在样本之间进行公平的基因比较。 img 为了执行归一化的比率中值方法,DESeq2有一个estimateSizeFactors()函数,它将为我们生成大小因子。我们将在下面的例子中使用这个函数,但是在一个典型的RNA-seq分析中,这个步骤是由DESeq()函数自动执行的,我们将在后面看到。 代码语言:javascript ...
RNA-seq数据标准化是为了消除实验中不可避免的技术偏差和样本间的生物学变异,以确保基因表达数据的可比性。以下是一些常见的RNA-seq数据标准化方法: 1.RPKM/FPKM (Reads/Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads): 考虑了转录本长度和测序深度的影响。
RNA-seq数据分析 判断测序的质量 分析的第一步,一般是先把测到的RNA片段,先mapping(比对)到基因组上。在比对完后,可以先看一下,有多少RNA片段是在靠近基因的5'端位置,又有多少片段在是靠近基因的3'端位置。 上图就是把所有的基因,都按其外显子的长度拉直,然后归一化到“0 - 100”的长度。看比对上的片段...
目前,普通RNA-seq测序已经成为科研中一件非常稀松平常的事,这也是得益于其物美价廉的基础。虽然已经有不少成熟的RNA-seq分析流程存在,但并没有形成一个统一的标准答案。毕竟,条条大路通罗马,走哪一条都可以得到想要的结果,这也无伤大雅。就拿我们今天要说的RNA-seq的标准化方法来说就不止一种,可供选择...
RPKM与FPKM的区别:RPKM值适用于单末端RNA-seq实验数据,FPKM适用于双末端RNA-seq测序数据。 RPKM/FPKM适用于基因长度波动较大的测序方法,如lncRNA-seq测序,lncRNA的长度在200-100000碱基不等。 TPM (Transcript per million) TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似,首先使用式2计算每个基因的表达值,去除基因长度的影响。随...
过去常常使用RPKM和FPKM对样本基因进行标准化,但是现在更常用的是TPM。但是在edgeR或者DEseq2中均未使用这些标准化的方法,而是使用其他方法作为替代,这在接下来的学习中将一一提及。 1. RPKM和FPKM:消除测序深度和基因长度对结果的影响 测序的深度越深,匹配到每个...
差异分析以及后面标准化这里使用的是Deseq2这个包来完成,首先构建dds对象,构建这个对象需要两个文件,一...