转录组测序(RNA-Seq)的研究对象是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。新一代高通量测序技术能够全面快速的获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,从而准确地分析基因表达差异、基因结构变异、筛选分子标记(SNPs或SSR)等生命科学重要问题。 A workflow for RNA-seqRuairi...
我们一般的RNA-seq要测的,也是mRNA的各种变化,所以,在实验过程当中,我们一般要把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。 去除核糖体RNA,并进行建库的方法有许多种。目前应用最广泛的是illumina公司的TruseqRNA建库方法。 上图是mRNA测序的建库过程图。 首先,利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点,用带有Poly(T...
这意味着要测序的RNA大约在100M nt(如果读长为单端100nt,相当于reads为1M) reads:高通量测序平台产生的短序列就称为reads(每次测序的读长,体现在fastq文件),也称为一个读段,reads可以是单独一条,成为Single End reads,简称SE read,也可以是两条具有物理关系的一对reads,根据reads方向,可以分为Pair-end reads...
以2G,PE100测序的表达谱项目为例,其对应的测序量为20M条reads。如果一条长度为1kbp的低表达基因的表达量为RPKM=0.5,其理论上可以检测到的reads数为20×0.5=10。所以低丰度基因的检测,对RNA-seq这个技术来说并非最大问题。 如上图,大部分RNA-seq类项目,老师都会看到测序的饱和曲线达到平台期。也就是说再增加测...
RPKM与FPKM的区别:RPKM值适用于单末端RNA-seq实验数据,FPKM适用于双末端RNA-seq测序数据。 RPKM/FPKM适用于基因长度波动较大的测序方法,如lncRNA-seq测序,lncRNA的长度在200-100000碱基不等。 TPM (Transcript per million) TPM的计算方法也同RPKM/FPKM类似,首先使用式2计算每个基因的表达值,去除基因长度的影响。随...
RNA-seq文库的测序读长分配到每个样本上的话,每个样本会测到平均20-30 million条读长(reads)(也就是常说的20-30M条读长),数据经过处理后,使用这些读长对每个基因或转录本进行定量,最后再用统计学方法来统计基因的差异。短读长RNA-seq方法很稳健,并且通过对短读长测序技术的大范围比较发现,这种技术在平台内和...
列:在测序数据中,通常有6到800+个样本。对于混合组织(bulk)RNA-seq,样本由很多不同的细胞组织,这样的测序可能需要3个正常样本和3个疾病样本,共计6个样本;对于单细胞RNA-seq,每个样本为单个细胞,这样的测序往往有更多的样本,可以达800+个。随着测序技术的发展与普及,测序的费用越来越低,...
RNA-seq的counts值,RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同 现在常用的基因定量方法包括:RPM, RPKM, FPKM, TPM。这些表达量的主要区别是:通过不同的标准化方法为转录本丰度提供一个数值表示,以便于后续差异分析。 标准化的主要目的是去除测序数据的技术偏差:测序深度和基因长度。
RNA的结构变异分析 需要测序深度较深,建议10G以上数据量。 可变剪接 融合基因 一个癌细胞中的融合基因示意图 融合基因交接点 点突变 表示点突变的泡泡图 Frequency越高,泡泡越大,逆时针排列。 以上内容均源于网络视频《陈巍学基因——视频7:RNA-seq》。
RNA-seq数据毫无疑问是目前NGS领域被使用最频繁的了,但是大部分科研人员对它的理解,还停留在表达量层面,尤其是基于基因的表达量,无非就是分组,然后走差异分析这样的统计学检验,绘制火山图和差异基因热图,上下调的通路。全部的学习资料我都视频录制免费共享在B站了: ...