RNA-seq时文库构建的大致过程 主要步骤如下: 1.1 提取总RNA 1.2 因为真核生物成熟mRNA有ploy(A)尾,而其他RNA没有,所以可以用带Poly T探针的磁珠与总RNA进行杂交从而去除其他RNA 1.3cDNA第一链合成:随机六聚体引物(random hexamer primer),逆转录酶以mRNA为模版合成cDNA 1.4cDNA第二链合成:第二链合成并删除mRNA,...
QuantSeq采用oligo dT引物特异逆转录含poly(A)尾mRNA,第二链使用随机引物进行合成,随机引物结合的位置与poly(A)之间的距离决定了插入片段的长度,因此不需要poly(A)富集及片段化这一步骤,并在cDNA合成后立即进行PCR,从而取代了接头连接步骤使整个建库流程时间大大缩短。这种方法可以在低测序深度上实现与标准RNA-seq同...
这种情况在短读长RNA-seq中也会导致可控的3ʹ端偏好,但对定位于应用长读长的RNA-seq分析全长转录组的研究者来说,即使是低水平的RNA降解,效果也会受限。因此,相关研究者需要在RNA提取后进行严格质控。其次,中位读长长度也会受到文库制备中的技术问题与技术偏好的限制,例如cDNA合成过程中的截断或降解的mRNA反转录...
因为II代测序(NGS)的illumina测序不能测很长的seq,约为200-700bp,所以不能测得mRNA全长,因此需要进一步把合成的cDNA利用酶打断到illumina能测的长度(长度有些随机,比如300bp的cDNA能通过头尾150bp完整测序,但700bp的cDNA只能通过头尾150bp测序+参考基因组推断出来)。然后在cDNA的3'端插入Truseq Read2引物(和Trus...
然后作者使用F2 / R2的不同引物组对每个circRNA进行qPCR。首先在分析样品中验证hsa_circ_0001821的上调和hsa_circ_0077837下调(图2e和i),然后在独立的样品群中确认(图2f和j)。这些circRNA的不同的NSCLC亚型特异性失调表明它们的亚型特异性生物学功能。
2. RNA-seq的主要步骤 2.1 准备RNA测序文库(基于illumina protocol介绍) 具体而言,建库又分以下步骤: Step 1: 提取待测样本的RNA Step 2: 将RNA打断成小的片段。 RNA的长度有数千个碱基,而测序仪的读长只有200到300个bp,故打断成片段后才能完成测序。
Short-read短读长:测序得到的长度最大是500 bp的reads,常见的测序片段长度为100-300 bp。 Long-read长读长:测序得到的超过1000 bp的reads,代表全长或近乎全长的mRNA。 Direct RNA sequencing(dRNA-seq):直接测序RNA而非cDNA的测序技术,通常用于测序全长或近全长的mRNA 。
3'-DGE RNA-Seq文库的cDNA合成步骤不是使用随机引物,而是使用带有oligo(dT)的接头的引物和转录本的polyA尾巴互补结合进行PCR扩增。这意味着3'-DGE的reads往往只映射到转录本的3'-端。由于理论上转录本分子和cDNA分子之间存在1比1的相关性,因此转录本的长度无关紧要,映射到基因上的reads数量只取决于转录本丰度。
RNA-Seq技术在药用植物应用中有2点缺陷:一是SSR出现频率不确定性,得到的unigene序列长度较短,难以获得同源性比对,这在一定程度上增加了基因功能注释的难度;二是基因数据库中的生物信息暂时缺乏,一些表达不丰富的基因可能无法获得准确的功能注释。 结合RNA-Seq的技术优点和...