转录组测序（RNA-Seq，RNA sequencing）是通过高通量测序技术对生物体内全部转录产物（包括mRNA、非编码RNA等）进行测序的技术。转录组测序能够定量检测基因表达、发现新的转录本、分析基因结构变异和识别基因表达调控网络，是揭示基因功能和调控机制的重要手段。一、转录组测序的概念与原理 转录组是指一个细胞、组织或生...
1. 基因定量 1.1 进入RNA-seq环境 1.2 使用featureCounts进行基因定量 1.3 计算FPKM和TPM RNA-seq这一期的项目这一章就结束了,之后我会整理做一个整体的流程介绍。 本章将带领大家掌握统计每个基因内的reads数量并计算每个基因的FPKM和TPM数值。 1. 基因定量 1.1 进入RNA-seq环境 使用如下命令进入环境: # 1. 进...
1.序列比对及表达定量。 首先是测序得到的fastq文件,通过和参考序列的比对和表达定量,生成原始的定量结果(如下图所示)。最左列是基因名,最上列是不同细胞系/不同处理的名称,中间的数字就是对测序结果的定量值(绝对定量)。 2.数据标准化。 DESeq2将对原始reads进行建模,使用标准化因子(scale factor/size factor...
通过RNA-Seq,可以获得基因的表达量信息,以了解哪些基因在特定条件下活跃或沉默。下面是一些关于RNA-Seq基因表达量的基本概念: 1.基因表达量的测量单位: 基因表达量通常以FPKM(每百万个碱基对的片段数)或 TPM(每百万个转录本的片段数)为单位来表示。这些单位考虑了测序深度和基因长度的因素,使得可以比较不同基因在...
转录组测序是最常用的组学实验,对全谱基因定量,找到差异表达基因。RNAseq涉及到原始数据,数据质控,基因组比对,差异基因鉴定,差异基因功能富集分析,重要基因如转录因子激酶的靶基因预测等,我们用10讲的时间,全面讲解转录组测序报告,及在上百个项目中遇到的近百个常见问题。
常规转录组分析是针对于整个基因定量的,因此可以针对多个转录本共有的外显子去设计引物,从而验证基因的表达;如果是对特定转录本分析的话,可能需要找到整个转录本特有的外显子部分设计引物验证。另一方面,设计完引物后,可以通过NCBI的Primer blast去看看设计的引物是否在基因组里是特异性扩增的。
从上面展示的基因表达值,可以看出两者的结果很一致。当然,这几个基因并不能代表整体结果,为了全面比较,用两者全部基因的表达值做如下的散点图: 果然,意料之中的结果,相关性0.99,两者的整体一致性非常好。RNA-seq定量直接使用STAR不失为一条快捷方便的途径。
RNAseq定量方法 一、比对参考基因组还是参考基因集 为了获取表达矩阵,可以将测序数据比对到参考基因组然后通过坐标文件 GTF(GFF 或者 BED)统计每个基因比对上的数据计算丰度,或者直接与参考基因集进行比对,直接计算每个基因覆盖深度的方法。但是两种方法之间有较大的差别:...
做RNA-seq,我们会得到一个纵轴是gene,横轴是样品的表达矩阵,如果用RPKM/FPKM定量,材料i所有基因的表达量之和与材料j的不一定相同(表达矩阵的两列),不适合材料之间的比较,可用于同一材料比较不同基因的表达水平;用TPM定量,任意材料所有基因的表达量之和都是1,可用于比较不同材料间的基因表达。