⑥ 去交联: 通过加热或酶处理,解除RNA和蛋白质之间的交联,将它们释放到溶液中。 ⑦ RNA提取: 从免疫复合物中提取RNA,使其可以进行后续的分析,如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA测序或微阵列分析。 RNA pull-down RNA pull-down的主要目的是通过特定的RNA分子(通常是已知的非编码RNA或mRNA的片段)来富集与之...
RNA免疫沉淀RIP实验流程 分离的 RNA 可以通过多种分子方法进行分析，包括终点 RT-PCR 和定量 RT-PCR（如果 RBP 的结合目标已知）、微阵列或深度测序方法。RIP技术应用背景 RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发...
结合的RNA序列通过定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。 实验方法 01 蛋白A琼脂糖凝胶和抗体的固定 取被protein-A包裹的磁珠悬浮液,先用PBS洗涤,然后用NT2缓冲液洗涤磁珠两次。 将NT2缓冲液和BSA添加到磁珠悬浮液中,在室温下搅拌培养2小时。 将抗体添加到上述步骤得到的混合物中,然后在室温下孵育1小时...
运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量...
理论上,可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本,再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase,以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。 7:因为RIP做完得到的是RNA序列,要做后续检测,比如测序、判断目标序列位置等,是不是都必须要做RT-PCR,...
RIP的实验原理和CHIP类似，是利用某一蛋白的抗体，将目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以捕获和目标蛋白互作的RNA分子，再对捕获的RNA进行定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来进行鉴定。RIP实验当前已经衍生出很多方法，可以主要分为两大类，自然沉淀法（Native methods）和交联RNA...
运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列可通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR高通量...
结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。 技术流程 建库过程 RIP实验步骤 一、获取细胞裂解液 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至eppendoff管 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞 ...
4、结合的 RNA 序列通过 microarray(RIP-Chip),定量 RT-PCR 或高通量测序(RIP-Seq) 方法来鉴定。 RIP实验基本步骤 一、细胞裂解液获取 A.单层细胞或者贴壁细胞处理 1、冷 PBS 清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次; 2、加入冷 PBS 后用细胞刮将细胞刮下来,收集至 enpendoff 管; ...
接下来，通过microarray（RIP-Chip）、定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）等方法鉴定结合的RNA序列。RIP技术类似于广泛使用的ChIP技术，但其关注对象是RNA-蛋白复合物，而非DNA-蛋白复合物。RIP技术在生物科学研究中起着关键作用。它有助于揭示RNA结合蛋白在细胞内的功能和作用机制，进而深入理解基因表达...