1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞),加800ul Trizol,后加糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应。 2.匀浆后,加氯仿前,样品可在-70℃放置一个月以上。RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8℃一个星期或-20℃一年以上。如果要长期保存,
实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。① 荧光染料法（SYBR Green）：SYBR G...
实时荧光定量PCR(realtime PCR)一、 样品RNA的抽提 1. 取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,...
Real-time PCR，即实时荧光定量PCR（qPCR），是一种强大的分子技术，能够在实时状态下监测和测量DNA的扩增。该技术通过对传统PCR的改进，实现了对特定DNA序列的高精度、高灵敏度和快速检测与定量。Real-time PCR在每次扩增循环后测量PCR产物的积累，从而能够在反应的对数增长阶段进行量化。这种实时监测的特性使得该技术...
real time PCR 的定量使用荧光色素,目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素,例如SYBR Green荧光染料;另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针(probe),如Taqman探针。、 两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光,当反应体系中存在双链DNA时,SYBR Green与双链DNA...
该法是最早用于定量的方法,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
因为RT-PCR只可以定性,但不能进行定量分析。与RT-PCR一样,RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法:一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA,然后再将其作为qPCR扩增的模板,只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行,两步法中的RT和qPCR是...
1 聚合酶链式反应反应(PCR) 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)已成为生物科学、诊断学和法医学最有价值的生物技术之一。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)可以将非常少量的 DNA…
最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。 做Real Time PCR时,用于SYBR Green I/Eva Green法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数...