设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 3. 标准曲线线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻...
对于一个 Real-time qPCR 而言,好的引物是实验本身成功的 50%,Real-time qPCR 引物的设计遵循下面一些原则: 扩增产物长度在 80-150 bp 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 产物不能形成二级结构,且长度一般在 15-30 碱基之间 G + C 含量在 40%~60% 之间 碱基要随机分布 引物自身不能有连续 4 个...
2.考虑到市面上酶的扩增效率,以及实验操作的简便性,RT-PCR 的检测引物长度一般控制在 100bp-200bp 的范围。3.为了避免 RT 检测引物和基因组 DNA 的非特异性结合,推荐使用含基因组 DNA 去除成分的反转录试剂。4.RNA 的污染无处不在,建议提取 RNA 的过程在超净台中进行。5.为了防止非特异性扩增,一般设置...
1. 为了避免检测mRNA时基因组序列的干扰,设计探针时尽量选择在跨内含子的部位。2. 通常探针的长度(既PCR产物长度)以100-400bp为宜,过长不易穿透组织,杂交效率减低;过短特异性低。 而Realtime引物设计:1.产物长度80-150bp为宜,可延伸到300bp。而且你做实时定量的时候,还要做标准曲线,确定引物的扩增效率好不...
通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80- 150bp之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序, 仪器都有默认设置,或者稍有不同,但都是一个...
要做real-time PCR了,设计了引物,产物长度接近250bp。根据参考资料只要在300bp内都是可用的。但是今天导师的意思是重新设计引物,要在150bp左右,因为actin的长度是159bp。虫虫中肯定有做过的,不知道250bp的长度是否会影响结果?我实在不想重新设计引物,因为又要等一周。在此请教了。 返回小木虫查看更多分享...
Real-Time PCR操作手册 0904
1、引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端...
一般real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则: 扩增产物长度在80-150bp。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 产物长度一般在15～30碱基之间。 G+C含量在40%～60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。