四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR 1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3 μl按10倍稀释(加水27 μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。 2. 反应体系如下: 标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green...
做RealTimePCR时,用于SYBRGreenI/EvaGreen法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求: ①Tm=55-65℃ ②GC=30-80% ③PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-300bp之间都可。 ④引物的退火温度要高,一般要在60℃以上。 要特别注意避免引物二聚体和非特异...
1) 将2XAllinOneTMQ—PCR Mix在室温下融解.轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心。同时在使用过程中始终保持避光。 2) PCR reaction mix的制备 (在冰上操作) 试剂 用量 终浓度 2XAllinOneTMQ—PCR Mix 10μl 1× ddH2O 1μl PCR Forward Primer(4μM) 2μl 0.4μM PCR Reverse Primer(4μM) 2μl 0.4...
*2 反应体系可按需求相应放大,10 μl反应体系可最大使用1 μg的Total RNA。 *3 应用Gene Specific Primer时,建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时,将温度升到50℃会有所改善。 ③ 将得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中,其加入量不要超过Real TimePCR反应体积的1...
Real-time PCR操作流程具体步骤如下：1. 收集样品。2. 准备相关试剂，包括总RNA提取试剂TREzol Reagent, M-MLV（cDNA逆转录酶），RNA纯化试剂，以及RealqPCR MasterMix（荧光定量PCR预混试剂）。3. 使用实验仪器，如荧光定量PCR仪、PCR仪和低温离心机。4. 提取总RNA。5. 在0.5ml离心管中合成cDNA。
realtime pcr操作流程 实时荧光PCR操作流程:样本准备→核酸提取→引物探针设计→试剂配制→样本与试剂混合→PCR体系上机→设置实验参数→进行扩增反应→收集实时荧光信号→分析数据得出定量或定性结果。©2022 Baidu |由 百度智能云 提供计算服务 | 使用百度前必读 | 文库协议 | 网站地图 | 百度营销 ...
实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。
PCR Reverse Primer(4μM) 2μl 0.4μM cDNA 5μl 总体积 20μl 注意:在实验中也设计了NTC(No Template Control),其为阴性对照,即在反应中用水来代替模板cDNA,其它试剂不变.从而来质控是否体系有污染。迅速将PCR reaction mix稍混匀,并加入8联管中。
反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求: 1)随机六聚体引物: 当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所...
实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。