*注:反应体系可按需求相应放大,10µl反应体系可最大使用500ng的Total RNA;最后得到的RT反应液(cDNA溶液)加入到下一步的Real-time PCR反应体系中,其加入量不要超过Real-time PCR反应体系的1/10(V/V)。 (2) 将反应液轻柔混匀后进行反转录反应,条件如下: 37°C 15 min(反...
我以ABI 7500fast为例,采用subgreen荧光染料,按照以下反应体系进行配比: 序号 反应物 剂量μL 1 上游引物Forward 0.6 2 下游引物Reverse 0.6 3 SubGreen染料 10 4 cDNA 5 5 DEPC水 3.8 总 20 μL 反应温度为: 95℃预变性3min, 随后40个PCR循环(95℃ 3 seconds;60℃ 31 secends),最后加上溶解曲线即可...
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值...
Real-Time PCR (RT-PCR)之五: PCR reaction for DARC 刘小丰 引物溶解:引物到手后可以先-20°C冻存,取用时,先室温放置5分钟,融化,接着高速离心,如12000rpm,10分钟。之后根据说明书放入一定量的TE buffer,振荡混匀。 一、PCR反应:(25ul反应体系) 每管内容:加样顺序及方法: ①. 1只Eppendorf管,依次加入...
Real Time PCR(qPCR),即实时荧光定量核酸扩增检测系统,是一种利用荧光染剂检测每次PCR循环后产物总量的方法技术,是常规PCR的衍生反应。主要是通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。因其具有灵敏、特异、精确以及使用简便等优点,现已发展...
*2 反应体系可按需求相应放大,10 μl反应体系可最大使用1 μg的Total RNA。 *3 应用Gene Specific Primer时,建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时,将温度升到50℃会有所改善。 ③ 将得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中,其加入量不要超过Real TimePCR反应体积的1...
Real Time PCR(qPCR),即实时荧光定量核酸扩增检测系统,是一种利用荧光染剂检测每次PCR循环后产物总量的方法技术,是常规PCR的衍生反应。主要是通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。因其具有灵敏、特异、精确以及使用简便等优点,现已发展...
PCR反应的基本原理请参考分子克隆第三版P611 从上面推导过程可以看出,在相对定量过程中,我们已经假定了内参基因和目的基因的扩增效率应该是一样的才能得出我们的结论。 2.如何带走我们实验数据的-ΔΔCT 理论上来说,应该使用目的基因和内参基因扩增至少5个...
实时荧光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,荧光定量)技术(Real-time quantitativePCR),是指在(QPCR,荧光定量)反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个(QPCR,荧光定量)PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR...