一、引物设计与选择 ⑴引物长度与GC含量: 引物长度建议控制在23-28个核苷酸之间,不超过30个。 GC含量应保持在50%-70%之间,以确保引物的稳定性和扩增效率。 ⑵Tm值设定: Tm值(熔解温度)应大于等于65℃,若Tm值超过70℃,建议使用Touchdown PCR策略,以提高产物特异性。 ⑶基因特异性引物(GSP)设计...
针对同一待测转录本可设计多条GSP,以提高扩增成功率。 若扩增效果仍然欠佳,则让NGSP(巢式引物)的5'末端与GSP的3'末端有5~15个核苷酸的重叠,有助于提高二轮巢式扩增时的特异性。 ▲避免引物自互补和错配: 避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和形成分子内氢键。 如果引物的3'末端有大约10个碱基...
特异性引物(GSP) 我用Primer3设计的GSP,会根据引物在序列的位置综合选择,GC含量大概是50%到55%,长度大概24-28bp。这个比例和长度可以参考实验记录。 第二轮扩增(巢式) 还是用降落法PCR。巢式引物(NP)是在原GSP的基础上,往前或后移动重叠10bp。这时不用管Tm值和GC含量了,NP和GSP形成内外引物。巢式扩增是为了...
Gene specific primers (GSP) 引物设计应满足以下要求: 引物长度为 23-28 nt,以保证特异性退火。 引物GC 含量在保持在 50%-70% 之间。 Tm 值对于产物特异性至关重要,设计引物时应保证 Tm 值≥65℃;如果 Tm 值>70℃,可以使用 Touch down PCR 方法进行扩增以提高产物特异性。
1、RACE技术-引物设计基因特异性引物(GSPs )应该是:1、2328nt2、5070%GC3、Tm值65度,Tm值70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5和 3RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2),由于两个引物的存在,PCR的产物是特异 性的。4、cDNA的合成起始于polyA+RNAo如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很...
首先根据mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部设计反转录引物逆转录获得第一条cDNA链。根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物(gene specific primer,GSP)合成第二条cDNA链。随后以基因特异性引物(GSP)及正义链3′末端引物作为一对引物,对得到的cDNA链进行PCR扩增,从而得到cDNA的3′端序列(基因特异性引物→3′末端)。
(4).引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和形成分子内氢键。另外,避免使用与AP1互补的引物,尤其是在3‘末端。 (5).如果要用重叠片段来检测设计的引物,GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用...
Tm值，即熔解温度，是评价引物性能的重要指标。一个理想的GSPs，其Tm值应至少达到65度，甚至70度以上，这样的Tm值可以确保在PCR过程中引物的有效解离和复性，从而获得准确的产物。在实际操作中，实验者需要根据已知的基因序列来设计两个特定的RACE反应引物，即5'端的GSP1和3'端的GSP2。由于这两个引物...
单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达,利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两...