通常,在科学实验中,我们会对所研究的目的基因进行表达分析,常用的方法有实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)。有些做RNA-seq的小伙伴,在做完转录组分析之后,一般也都会要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。这里我们讲一下常用的Livak法(2^-∆∆Ct法)是如何计算的,以及在qRT-PCR中常见问题和解决方案。
qRT-PCR实验原理 RT-qPCR由普通PCR技术发展而来,它是在传统PCR反应体系中加入荧光化学物质(荧光染料或者荧光探针),根据各自不同的发光机制实时检测PCR退火、延伸过程中荧光信号变化来计算PCR每个循环中产物的变化量,目前最常见的方法为荧光染料法和探针法。 荧光染料法: 一些荧光染料如SYBR Green Ⅰ,PicoGreen,BEBO等,...
qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)是实时定量PCR,指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录,由此可以对起始模板数量或最终复制数量进行精确分析。 Real-time PCR 比qRT-PCR稍微宽泛一点的概念。Bio-Rad公司主页对Real-time PCR和qPCR的定义是这样的: Bio-Rad定...
qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR) 原理:结合RT-PCR与qPCR的原理,先将RNA逆转录为cDNA,再进行qPCR的实时定量扩增。 步骤: 使用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。 通过qPCR技术对cDNA进行实时定量扩增。 应用:定量基因表达,RNA水平的动态监测。 技术对比表 对比项目PCRRT-PCRqPCRqRT-PCR 模板 DNA RNA DNA...
碧云天的BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit是一种基于SYBR Green染料用于一步法反转录实时荧光定量PCR,即qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR)或real-time RT-PCR的高品质预混液,主要用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。 BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit以提取的RNA为模版,...
qPCR则代表实时定量PCR(quantitative PCR),即实时监测PCR扩增的过程。 📝 在科研论文写作中,使用RT-qPCR更为规范,因为它清晰地表明逆转录(RT)是定量PCR(qPCR)的前置步骤。虽然qRT-PCR也被广泛使用,但可能会让人误解为“qRT”是一个联合的步骤。 💡 因此,为了确保研究的严谨性和可读性,建议在使用这些术语时,...
QRT PCR一般指以RNA为模板,先逆转成cDNA,再进行qPCR。更容易突变,因此种类更多,更难研制有效疫苗,难以预防。RNA病毒的抵抗力普遍比DNA病毒弱,治愈也更容易。但也有例外,例如双链RNA病毒的抵抗力就很强,逆转录病毒的治愈就极其困难。植物病毒,除少数例外(如花椰菜
1.样本是否是同一批次样本进行转录组和QPCR分析? 2.挑选验证基因时,挑选的基因是否序列较短或者外显子较少? 3.是否低表达的基因比例过高(对于低表达基因,转录组表达量结果准确性偏低)? QPCR结果不准确: 1.查找实验环节是够存在问题? 2\. 内参基因是否稳定?
qRT-PCR和RT-qPCR在本质上是相同的,它们都是指实时定量逆转录聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction),用于检测RNA的表达水平。 技术原理:在qRT-PCR或RT-qPCR中,首先通过逆转录(Reverse Transcription)将RNA逆转录为cDNA,然后使用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction...
RT-qPCR流程设计 一、概念甄别:qPCR? RT-qPCR? qRT-PCR? PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链反应)是一种常用的分子生物学技术,用于扩增DNA片段。它利用DNA聚合酶在模板DNA上的反复扩增(涉及到三个步骤:变性、退火和延伸)来实现短时间内产生大量特定的DNA序列。PCR技术已经被广泛用于基因检测、病毒检测、DNA...