在进行引物设计的时候应该注意引物序列是跨越基因内含子可以区分并且规避基因组DNA污染(建议在进行逆转录时候直接使用去基因DNA)。设计引物时需要让一端或两端引物跨越内含子,以人基因组来说,平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子,80%的外显子长度小于200bp,少于10%的内含子长度在1100bp以上,不到0.01%的内含子...
例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽可能的跨内含子-外显子;(7)参考上节引物设计规则;(8)其它。
2.2 qRT-PCR 引物设计方法 如图所示,我们一般进行定量的方法都是SYBR Green ,里面也可以选择TagMan进行引物设计。 这里介绍的是Beacon Designer 软件设计引物的方法。 根据引物设计原则可以更高GC含量,引物长度,Tm值,产物长度等等。 下面再介绍一种使用primer3Plus 设计引物,Primer Blast 进行引物特异性验证的方法。 首...
1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子之间,横跨中间的内含子,这样可以避免DNA的污染; 2)用于过表达基因表达量时,需找出该家族所有同源基因并进行比对,并在保守性最差的区域设计引物; 3)用于标记基因检测的引物序列最好来自发表的文献。 除此之外,内参基因的选择也需要稍微走下心。以模式植物...
4、qRT-PCR 反应：设计并合成引物，随后以 cDNA 为模板，使用细胞炎性因子的特异性引物进行 qRT-PCR 扩增反应。反应完成后，确认扩增曲线和融解曲线，对标准曲线进行分析。5、数据分析：使用 qRT-PCR 仪检测荧光信号，导出 Ct 值，以β-actin 作为内参基因，采用 2-△△CT 法来计算细胞炎性因子的表达水平。五...
4. PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80～150 bp最为合适(可以延长至300 bp); 5. 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在; 6. 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不...
QRT-PCR引物设计概述：在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享...
大家都在说 qRT-PCR 实验原理、引物设计、结果解读等,而我觉得我应该和大家分享一下 qRT-PCR 的实验操作事项。虽小,但是关乎结果。 在做qRT-PCR 之前,我们需要对自己的 RNA 以及操作方法有清楚的了解,毕竟我们的努力是希望得到结果的,而不是简单的练练手。所以...
qRT-PCR的引物设计需遵循一般PCR引物设计原则并结合额外规则。首选扩增子大小为75-150bp，更长的扩增子（150-200 bp）可验证分析。引物应具有40-60%的GC含量，Tm接近60°C，3'端以2G/C夹紧，避免单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸重复，且避免引物的同源和异源二聚化。同时，设计引物时需关注目标上的...