实时定量反转录PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)是PCR技术的一项重大发展,它能够对PCR过程中每个周期产生的产物进行可靠的检测和定量检测。在引入寡核苷酸探针(qPCR引物)后,使得这种技术成为可能,寡核苷酸探针被设计用于在目标序列内杂交。由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性,在PCR过程中探针的切割可以用...
1.2 qRT-PCR引物 qRT-PCR是特殊的PCR和应该报告基因的结合体,所以qRT-PCR的引物设计要满足一般PCR引物设计的原则,此外还有一些额外的规则。首选扩增子大小为75 - 150bp,但必要时可以使用更长的扩增子(更短的扩增子具有更高的PCR效率)。使用稍长的扩增子(150-200 bp),使我们能够验证分析),40-60% GC含量,Tm...
一、原理 qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列，并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量，来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。二、用途 广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。三、材料与仪器 1、试剂：RNA 提取试剂...
原理qRT-PCR 从PCR到qPCR qPCR原理 荧光标记 Ct值 Taqman探针:探针两端分别接荧光基团 与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针, 分离荧光基团,使之荧光不被淬灭 染料荧光:SYBR染料,结合DNA双螺旋大 沟发荧光,与单链不结合 扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 (Cycle Threshold)。C代表Cycle,...
1、实时定量实时定量PCR (real-time quantitative PCR)目录目录一、实验原理二、实验优点 三、实验缺点四、实验应用五、实验简介 实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离。 评估...
Fig 1 qRT-PCR原理 引物设计 原则: 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好用cDNA序列,mRNA序列也可,如果没有则找出DNA序列的cds区域设计。 做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp 引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
QRTPCR引物设计概述:在QRTPCR过程中,由于涉及到模板定量,所以要求引物特异性强,并且不能扩增出基因组DNA如果用DNA酶处理干净另当别论,所以要求跨外显子设计可以不用考虑基因组DNA污染,或跨内含子设计检验DNA酶是否处理干净,即
⑥阈值周期(Ct):是定义为报告荧光大于阈值的分数PCR循环数。Ct是实时PCR的基本原理,是产生准确和可重复数据的重要组成部分(相对表达量的直接数值,是平时大家在qRT-PCR中直接关注的非常关键的数值) ⑦平台期:由于引物逐渐耗尽,扩增效率降低,逐渐进入扩增的平台期 ...
microRNA qRT原理microRNA qRT-PCR引物套装是包含了miRNA特异的逆转录引物,以及PCR正反向引物。通常样本采用U6作为miRNA检测的内参,适用于单个和多个样本不同miRNA的定量分析。 根据目的miRNA设计独特茎环和加poly(A)结构,提供人源、大鼠源以及小鼠源miRNA的逆转录引物及定量PCR引物,引物具有灵敏度高,可特异地结合miRNA...