最最最重要的是特异性(即只能扩增需要检测的基因),其他规则(1)引物长度为20- 21 bp;(2) 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基,例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽...
qRT-PCR有自己的引物标准,简单而言,引物设计要用专门的软件,qpcr引物设计原则包括内参基因与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外,还需要注意以下法则: 1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子之间,横跨中间的内含子,这样可以避免DNA的污染; 2)用...
我们都知道,qRT-PCR有着自己的引物标准,通用的是打开PrimerBank:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/,相信这个操作大家并不陌生了。(友情提示:跨内含子可以用primer 5设计引物呀)简单进行总结,引物设计需要专用软件,内参基因与目的基因在内的所有引物的Tm不可以超过两度。特别的,引物设计的好坏直接影响扩增效率...
实际上,在做qRT-PCR之前,我们第一个需要确定的是内参基因,根据自己实验材料和检测的基因选择好适合的内参基因后。开始为自己的片段设计引物。与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外,还需要注意以下法则:(1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子...
3. 模板浓度高或有抑制物:模板的浓度过高或含有抑制PCR反应的成分,可能导致实验结果不准确。 4. 引物或探针不佳:引物或探针的设计不合理或质量不佳,可能无法有效进行PCR扩增或检测。 5. PCR酶的灵敏度可能因存储不当或过期而下降。 解决方法: 1. 严格控制标准品的加样体积,确保大于2ul。引物在使用前进行预混...
设计-丁香园茎环法原理:由于miRNA全部为23nt左右的短序列,无法进行直接PCR检测,所以使用了茎环序列这个工具,茎环序列是一段50nt左右单链DNA,可以自身形成发卡结构,3’末端可以设计成与miRNA部分片段互补的序列,那么在反转录时就可以将目的miRNA连接到茎环序列上,那么总长度就达到70bp,就符合qPCR确定的扩增产物的长度...
NCBI的primer- BLAST工具可帮助进行设计，输入碱基序列或文件，设定上下游引物起始位置，设定产物长度在85-300bp之间，然后点击“get primers”进行设计。设计完成后，需核对引物特异性，并保存所需的qRT-PCR引物。设计实例为：Forward primer: GAAAACAACCCTCAGACGCC Reverse primer: CGATCACTCCAAAGTGCAGC ...
One-Step qRT-PCR反应程序: 50℃ 10分钟一般可以得到理想的反转录效果,但如果片段较长,也可以适当增加。在Real-time PCR反应前进行模板的预变性,通常设定为94℃ 2分钟,复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本制品中的ByFast Taq DNA聚合酶可以在15秒内可完成至少300bp的扩增,可以满足绝大多数的qPCR实验;对于超...
QRT-PCR分为实时荧光定量PCR和非实时荧光定量PCR—两种检测方式，其特点是在进行PCR反应时，可以随时跟踪...