溶解曲线分析是基于PCR产物的熔解温度来判断目标基因的准确拷贝数。通过逐渐升高温度,DNA双链逐渐解离,并产生荧光信号的下降。溶解曲线图是以荧光信号强度(纵轴)和温度(横轴)为标度绘制的曲线,通过分析峰值的温度和形态可以确定PCR产物的特征。 溶解曲线分析可以用来检测PCR反应的特异性和杂交偶联的问题。通过观察溶解曲线...
① 非特异性扩增：当PCR反应条件不够好或引物与非目的基因序列匹配时，可能会导致非特异性扩增产物的形成。这种情况下，熔解曲线可能显示出多个峰。可通过优化PCR反应条件（进行温度梯度PCR实验，尝试不同温度和延伸时间）、根据引物设计原则来设计新的引物等方法以增加特异性。② 引物二聚体：引物对之间的非特异性结合...
PCR产物的特异性对于结果也至关重要。通过对PCR反应后的溶解曲线进行分析,可检测产物的特异性:溶解曲线应该显示出一个单一尖锐的峰。 ▼ AtaGenix出品的典型的溶解曲线是这样的 此外,应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小是否正确。 7数据分析 在qRT-PCR实验中,内参基因被用来作为数据标准化的对照,以校正作为模板的cD...
实时荧光定量PCR(Real-time PCR, qRT-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 辉骏生物技术优势 1、实时监测:通过扩增曲线能够实时监测PCR产物的积累 2、特异性强:溶解曲线分析可以检测扩增产物的特异性,降低假阳性 3、精确定量:利用...
在qPCR中，扩增产物的数量在每个PCR反应周期使用荧光值被测量。利用的底物或者模板是cDNA (complementary ...
分析Real-time PCR数据的方法可以分为绝对定量和相对定量。 绝对定量(Absolute Quantification,AQ)是为了计算在未知样本中,某个核酸序列的实际拷贝数量,这样计算需要先制作标准曲线,找到荧光强度和产物数量的线性关系。 相对定量(Relative Quantification,RQ)是测定在测试样本中目标核酸片段与校对样本中同一序列片段的相对比例...
熔解曲线(Melting Curve),是用于检测PCR产物的特异性的一种方法。通常在PCR反应结束后,将温度从60℃升高到95℃,并记录PCR产物的荧光值,以绘制溶解曲线。根据PCR产物的特异性,可以得出产物的Tm值和是否存在非特异性产物的信息。 SYBR Green染料没有序列特异性,对DNA模板没有选择性,可以结合到包括非特异产物和引物二...
溶解曲线是反映引物的特性的。溶解曲线主峰为单峰说明引物特异性好，如果是双峰或则多峰说明引物特异性差...
逆转录-聚合酶链反应大概是我们接触到的第二个PCR技术。 原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术...