一、原理 qPCR 技术通过引物特异性扩增目标 DNA 序列，并通过荧光探针或 SYBR Green I 荧光染料法检测 PCR 产物的数量，来定量分析样品中目标序列的数量。qPCR 技术具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。二、用途 广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。三、材料与仪器 1、试剂：RNA 提取试剂...
(1)反转录是指在逆转录(或反转录)酶的作用下,以mRNA为模板合成cDNA分子的过程;由于启动子和终止子等调控因子不编码蛋白质,因此与原基因相比,其反转录形成的cDNA分子不具有启动子和终止子等调控因子。(2)扩增:用PCR扩增cDNA,首先要制备2种引物,以便为热稳定DNA聚合(或Taq)酶提供结合位点,并从引物的3′端开始...
3)PCR反应效率:在72℃下,Taq DNA聚合酶酶活的效率更高,因此理论上PCR反应效率更高。但是,在实际应用中,由于高温下的非特异性扩增和错误连接,可能会导致PCR产物的杂交和竞争,影响PCR反应的效率和特异性。 4)循环反应需要进行多次(通常是30-40次),以扩增足够的DNA或RNA产物。通常来说,循环反应40次(1+39)普遍...
qRT-PCR的原理：以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。通过实时检测PCR扩增过程中荧光信号的变化，可以获得关于相对定量基因表达水平的信息。qRT-PCR一般包括SYBR染料法和Taqman探针法。例如，SYBR染料游离时发出的荧光信号微乎其微，但当其与双链DNA的小沟结合后，荧...
4 qRT-PCR 定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction),也称为qRT-PCR,用于检测和定量RNA。在qPCR中,扩增产物的数量在每个PCR反应周期使用荧光值被测量。利用的底物或者模板是cDNA(complementary DNA, cDNA),而cDNA是Total RNA(总RNA)或mRNA首先转录合成。然后将cDNA用作qPCR...
一、qRT-PCR定量原理 qRT-PCR，即实时荧光定量PCR，就是通过对PCR扩增反应每一个循环产物荧光信号的实时...
RT-qPCR的原理涉及两个主要步骤:逆转录和PCR扩增。 逆转录是将RNA通过酶的作用,转录成DNA的过程。首先,逆转录酶(RT酶)会结合到RNA模板的3'末端,并合成一条与RNA互补的单链DNA(cDNA)。这个过程称为逆转录。RT酶需要一个引物,称为逆转录引物或随机引物,用于提供链延伸的起始序列。此外,RT过程还需要逆转录缓冲液...
与qRT-PCR一样,它也是对RNA进行定量分析的技术,包含了逆转录和实时定量PCR两个步骤。 二、技术原理 这两种技术都遵循以下原理: RNA逆转录:从组织或细胞中提取总RNA,利用逆转录酶和特异性引物(如Oligo(dT)或随机引物)将RNA模板逆转录成cDNA。 实时定量PCR扩增:以cDNA为模板,加入特定的引物和荧光标记物质(如SYBR...
从操作到实践：qRT-PCR的详细步骤 在实践中，qRT-PCR的每一步都需精确执行。以96孔板为例，合理的布板设计（表1）是关键。上样时，遵循试剂盒指示，包括引物、cDNA模板和ddH2O等（表2）。qRT-PCR的扩增程序包括变性、退火和荧光数据采集（表3），而溶解曲线的获取也是标准步骤。数据处理采用经典的2...
方差分析，T检验均是对比差异性的方法。对于T检验的X来讲，其只能为2个类别比如男和女。如果X为3个...