最最最重要的是特异性(即只能扩增需要检测的基因),其他规则(1)引物长度为20- 21 bp;(2) 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基,例如AAAAA或GGGGG;(3)每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性);(4) GC含量为45%~55%;(5)PCR产物大小为85~300 bp;(6)引物尽...
(图1 引物扩增示意图。 PCR基因扩增方向和体内合成方向是一致的,即从5'端到3'端。) 引物设计也应该注重以下规则:引物的结构应相对简单,不含内部二级结构,避免内部折叠;我们还需要避免引物-引物退火,它会产生引物二聚体并破坏扩增过程;在设计时,如果不确定在引物的某个位置放置什么核苷酸,可以在该位置包含多个核苷...
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4、qRT-PCR 反应：设计并合成引物，随后以 cDNA 为模板，使用细胞炎性因子的特异性引物进行 qRT-PCR 扩增反应。反应完成后，确认扩增曲线和融解曲线，对标准曲线进行分析。5、数据分析：使用 qRT-PCR 仪检测荧光信号，导出 Ct 值，以β-actin 作为内参基因，采用 2-△△CT 法来计算细胞炎性因子的表达水平。五...
反转录:合成cDNA。 配置qRT-PCR反应体系:加入引物等。 扩增反应:设置合适的程序,上机进行扩增。📊数据分析: 软件选择:使用合适的软件(如Bio-Rad CFX Manager等)。 Ct值分析:通过相对定量(如2⁻ΔΔCt法)计算基因表达差异。📚最后,为大家整理了qPCR等细胞实验的手册合集,免费分享!💪0...
PCR 是使用DNA聚合酶酶(Taq酶)在高温下在寡核苷酸引物的控制下在DNA模板的两条链上进行扩增的过程。扩增的关键是通过引物的互补序列选择性地合成特定的DNA片段。 PCR过程通常包括三个主要步骤:变性、引物结合和DNA合成。变性步骤使用高温(通常为94-98°C)完全打开DNA的双链结构,使目标DNA的两条链分离。然后,使...
本文将详细介绍qRT-PCR的操作流程。 1. 实验前准备 在进行qRT-PCR实验之前,需要准备以下材料和设备: - RNA样本:提取需要研究的组织或细胞中的总RNA。 - 逆转录试剂盒:包括逆转录酶、随机引物、dNTPs等。 - PCR试剂盒:包括聚合酶、引物、dNTPs等。 - qRT-PCR仪器:包括逆转录仪和实时荧光定量PCR仪。 - 实验...
引物的设计 在Analyse this sequence列表中找到Pick Primers单击,方法如下,进入引物设计页面。当然也可在NCBI首页的下部找到Primer-BLAST,单击进入相同的页面。 然后将PCR product size 设置为100~200bp,返回的引物数这里保持默认的10对,退火温度保持默认。
实时PCR(RT-PCR)是一种使用荧光染料或探针(实验室通常称为引物)技术对样品中存在的核酸进行定量的技术或实现靶基因/序列的扩增。RT-PCR足以扩增目标是模板DNA (cDNA是其中一种),也就是说,它可以在PCR仪器(热循环仪器)复制DNA。它使我们能够研究目标序列或基因,因此一直是遗传学中的一项关键技术。