【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应;NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。 复孔重复性差 1加样误差导致,建议移液器定期校准,另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。 2模板量低,建议提高模板量,使Ct值落在15-30之间。...
若阴性对照（NRC）出现Ct值，而NTC未出现，这可能表明RNA样本中含有gDNA污染。为解决这一问题，建议使用DNase I进行消化处理，或者采用含有gDNA去除功能的反转录试剂盒。总之，NTC和NRC在qPCR实验中的扩增问题，往往与引物设计、反应体系污染或样本中存在的gDNA污染相关。针对不同的原因，采取相应的优化措施...
（2）扩增曲线断裂或下滑 比较典型的曲线下滑如上图所示，主要原因是模板浓度太高了，在基线期内就起峰...
在分子生物学实验中，qPCR（实时荧光定量 PCR）技术以其高灵敏度、高特异性和快速性等优点，被广泛应用...
2.降低退火温度,或选用三步法扩增;组分和体系充分混匀;优化反应程序;或尝试更换试剂。 Ct值过小 1.模板浓度高 2.NTC和NRC存在污染 3.引物设计不合适 1.减少模板RNA量;或更高比例稀释cDNA。 2.重新更换所有试剂;或使用UDGase防污染试剂。 3.优化程序,避免非特性扩增。
GenStarqPCR产品技术手册 GenStar qPCR 产品技术手册 1
A:曲线平滑;起峰时间正常;NTC 和NRC 无扩增( 起峰晚);Ct 值一般为18-30 之间。 Q:样品Ct 值大于30,该如何对待? A:对于Ct 值30-35 的样品可以通过NTC 的情况来判读结果是否有效,一般来说NTC 无扩增或者Ct(NTC)-Ct(simple)>5; 而大于35 的Ct 值可以认为是无扩增。
4)实验设置NTC、NRC、POS和NEG等对照组,来监控实验体系或污染; 5)标准曲线的建立(评价PCR效率)。 6、内参基因的选择 在RT-qPCR实验中,内参基因可以用于校正上样量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。一个好的内参基因应在不同时空样本或不同处理样本中具有相对稳定的表达水平,常见的有ATCB、GAPDH...
Ct值有什么作用? 1.指数扩增、模板量与Ct值的关系 理想情况下,qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累,扩增循环数和产物量之间的关系是:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数。然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下,当扩增产物量达到“一定产物量”时,此时循环个数为Ct值,处于指数扩增时期。Ct值与起...