可能是基线范围设置不当,这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值(一般建议设置为Ct值-4),调整后见下图。 扩增曲线平台期锯齿状 1)RNA纯度低,建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。 2)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。 扩增曲线杂乱无规律 可能是ROX浓度和机型...
简单讲,Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时,所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。 Ct值有什么作用? 1.指数扩增、模板量与Ct值的关系 理想情况下,qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累,扩增循环数和产物量之间的关系是:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数。然而qPCR反应...
但下图电泳结果显示实际上第6、7、8样品RNA已经降解了。此时用降解的RNA跑qPCR就很可能会出现内参的Ct偏高。 核酸电泳就用WIX水平电泳仪 *尺寸大,条带分离的更清晰,效果更好; *电极架采用卡扣卡紧方式,电泳槽底部无开孔,杜绝漏缓冲液,更换只需要几秒...
2、设置Tm，多次比较好，选择适合的Tm值。3、降低引物浓度。污染：重新制备cDNA模板。三、Ct值过晚出现...
原因分析:模板量过高及基线设置不当。 解决方法:减小基线的终点值,一般情况下选择Ct-4; 3.平台期锯齿状 原因分析:RNA纯度低,杂质所造成的干扰;仪器需要校准; 解决方法:增加稀释倍数优化反应,或者重新制备高纯度的RNA模板; 校准仪器即可; 4.扩增曲线杂乱无规律 ...
基线选取范围不对,基线终点大于Ct值,这通常是由于模板DNA浓度过高所致,因Ct值<15,而基线范围仍取3-15,其中包含部分扩增信号,导致标准差偏大,阈值过高,解决办法:减少基线终点至Ct前4个循环,重新分析数据。 疑问12 样品浓度跨度过大 答: 样品浓度过高,导致阳性样品扩增曲线在后面...
平台期下降可能是基线范围设置不当，模板量过高导致。调整基线终点值，将设置改为Ct值-4，以避免模板量过高的影响。扩增曲线平台期锯齿状，可能是由于RNA纯度低，增加模板稀释倍数或重新制备高纯度RNA。定期进行仪器校准保养，预防仪器长时间未校准导致的问题。如果扩增曲线杂乱无规律，可能是ROX浓度和机型不...
扩增曲线Ct值偏大 【可能原因】 1.模板量低。 2.扩增效率低。 3.PCR产物太长。 4.体系中存在抑制剂。 【解决方案】 1.减少稀释倍数或增加模板量,使Ct值尽量落在15-30之间。 2.优化反应条件,尝试三步法扩增程序或重新设计引物。 3.一般PCR产物长度设计为100 -150 bp之内,不建议超过300bp。
(5)无扩增或 CT 值很大 (图片来源于:丁香实验平台) 检查实验所用的酶是否为化学修饰的热启动酶,预变性时间至少 5 min,如果是高 GC 的模板,可以延长预变性时间至 10 min,预变性时间不够,会导致酶活未完全释放。 因此小伙伴们在使用 qPCR 试剂的时候,一定要注意分辨热启动酶的封闭手段。