qPCR(Real-time Quantitative PCR)即实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR),在PCR过程中加入荧光基团,根据荧光信号的变化实时监测扩增产物的变化。并通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。 实时荧光PCR的产物不同,主要方法分为三种,DNA结合染料法、探针化学法、淬灭染料引物法。 1、DNA结合染料法:与双链DNA小沟...
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。Real-timePCR原理 1.1荧光染料和荧光探针 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者...
不同的qPCR产物因其长度与GC含量不同,它们的Tm值大小也不一样。 根据此原理,我们可以知道。如果qPCR扩增体系不特异,出现一个非特异性扩增产物,qPCR最终的产物由目的产物+非特异性产物共同构成,因两者长度与GC含量不同,在融解曲线上会表现出两个Tm值,即两个波峰;若非特异性产物Tm值与目的条带的Tm值接近,融解曲...
qPCR常用的分析方法包括相对定量和绝对定量,目前市场上用的常用的是相对定量--即 SYBR荧光染料法,该方法实验前需要RNA提取、反转cDNA、设计qPCR引物等操作;实验设计一般需要考虑设置内参基因、以及阴性/阳性对照等;实验结束后需要对Ct值、扩增曲线、以及融解曲线数据进行分析。 1 qPCR实验前准备 (一)RNA模板 实验开始前...
# qPCR 数据分析科普 定量聚合酶链式反应(qPCR)是一种强大的分子生物学技术,用于定量分析特定DNA或RNA序列的丰度。它广泛应用于基因表达研究、病原体检测和基因组学研究。本文将介绍qPCR的数据分析方法,并配以代码示例,帮助读者更好地理解这一过程。 ## qPCR 基本原理 qPCR结合了PCR扩增和荧光检测的技术。与传统的...
一、qPCR原理：qPCR（Real-time Quantitative PCR）即实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR），在PCR过程中加入荧光基团，实时监测扩增产物的变化。通过分析Ct值和标准曲线，对起始模板进行定量分析。实时荧光PCR的产物有三种主要方法：DNA结合染料法、探针化学法、淬灭染料引物法。二、实验步骤：提取核酸、反转录...
熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性,理想的熔解曲线为单峰,异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况,下面我们来逐一分析。 1.熔解曲线出现双峰 1)双峰,杂峰Tm在80℃之前 ①可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式...
一文掌握RT-PCR..1)反应体系污染,结合NTC和NRC结果确认污染情况,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。 2)试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效,建议用新的试剂做对比实验。
Real-time qPCR数据分析 基线(baseline):通常是3-15个循环的荧光信号,同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。 阈值(threshold):自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增...