设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：引物尽量要跨内含子设计、产物长度100~300bp、Tm值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近、引物末端是G或C等等。1. 引物跨内含子设计 在设计qPCR引物时，选择跨内含子设计的引物可以使gDNA模板不能得到扩增，产物均来源于cDNA的扩增，这样也就去除了gDNA污染造成的影响。2. 引物长度...
1.qPCR引物的扩增产物通常控制在100-200bp左右；2.qPCR引物主要用于反映目的基因的表达量状况，所以引物序列只包括与目标基因互补配对的序列；3.若qPCR采用探针法进行，引物对需分别设置在探针结合序列的上下游；4.若qPCR采用染料法进行，引物对的靶点尽量设在CDS序列3’端。qPCR引物的设计通常是由引物设计软件辅助完成...
下面，我们以人的EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！01 查询基因结果 首先，通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构，这里要注意对比基因名称、种属，确保都要一致。02 确定引物位置 我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，所以需要找到这些...
02)点击General Settings按照荧光定量qPCR引物设计原则进行相关参数设置,例如扩增产物长度Primer Size Ranges、引物长度Primer Size、Tm值Primer Tm、GC含量Primer GC%。完成相关参数设置后,点击右上方绿色按钮Pick Primers,即可获得相关引物。 03) 获得相关引物序列后,到NCBI blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool...
一、PCR引物设计原则 首先，大家在进行qPCR引物设计时，为提高引物特异性，避免非特异性扩增，需要尽量遵循以下设计原则。二、PCR引物设计注意事项 1、产物长度：产物一般保持在200- 300 bp。产物长度过短，可能无法区分引物二聚体与目的产物；产物长度过长，则可能由于酶活限制影响扩增效率。2、转录本选择：若基因...
之前写的RNA-seq数据差异表达分析一文中提到,筛选得到差异表达基因list后,需要进一步分析这些基因参与了哪些功能,因此要进行后续的一些分析,比如功能富集分析、聚类分析和基因共表达网络分析。这次主要介绍在线功能富集分析与qPCR引物设计。其中在线功能富集分析可利用本人所在课题组开发的agriGO和PlantGSEA在线分析工具,分别进行...
写在前面:最近要跑大鼠样本的qPCR,文献中找引物序列太麻烦,且报道的文章比较少,所以又摸索了一番设计引物的方法,在此做个汇总笔记,也希望能帮助到有需要的人。 PrimerBank (PrimerBank (harvard.edu)) 这是我最常用的一个引物设计网站,只需要在NCBI上找到Gene ID就可以了,但是该网站只能选择human和mouse两个物种...
一．引物设计思路 根据不同的基因型情况：①杂合子或纯合子 设计思路：一条引物建议落在被敲除的序列上，另外一条引物落在外显子上；qPCR结果说明：通常纯合子CT值大于35，则可认为敲除成功；杂合子2^-(∆∆Ct)值一般<1（基因拷贝数不同，存在二倍体及多倍体等情况）；例：两条引物一般选择跨外显子（...
确定位置后,向上拉网页,在右侧点击Pick Primers,就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。 引物设计的第二步:生成引物 我们已经查到第1,2个外显子的位置是1-596和597-1467,在这两个区间设计引物,才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意,qPCR的产物大小...
一、qPCR引物设计的原则 特异性原则：引物必须与目标序列完全匹配，避免与其他非目标序列产生交叉反应。因此，在设计引物前，应对目标序列进行充分的分析和比对，确保引物的特异性。长度原则：引物的长度通常在18-25个碱基之间，这一长度范围可以确保引物的特异性和扩增效率。过短的引物可能降低特异性，而过长的引物则...