【求助】用pet28a表达不出蛋白] 最近构了一批载体,分别用不同基因片段连到pet28a上。用来原核表达,却怎么也表达不出来。试过不同的iptg浓度以及温度,都没有效果。而且我想那么多载体,连的不同的基因,在同一个条件下怎么一个都表达不出来呢。别人一搞就出来,我死活弄不出来,郁闷啊。 我的操作流程是挑单菌落,...
可是,跑sds-page的时候就是没表达。诱导前后没有特异条带,三个基因都是这样。呕血啊。大大们,帮帮我撒。 后面我又借用别人的PET32a,也进行了上面的实验,结果诱导前后只用表达标签蛋白(20kDa左右),目的蛋白是33kDa左右。 序列正确情况下要考虑到DNA序列在不同系统表达的差异。信号肽是个问题,但28a开始的那段可能...
大肠杆菌表达分子量超过100kDa的蛋白基本是看天命的。蛋白质太大了原核生物很难表达，就算表达出来了也...
1 可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是江始均施讲不...
看下面的两个蛋白电泳图,感觉应该是表达出了目的蛋白,但是用pet28a,N端加His,在BL21DE3中表达,表达出来的蛋白应该是8KDa左右,但是跑出来的条带在10到15KDa之间,这有些奇怪。我进行了蛋白提纯也提纯了出来如图第4.5.6.7是收集的洗脱蛋白,1是沉淀,2是上清,3是结合蛋白后的Wash buffer但是做了很多遍的Western blo...
(4)图2中将构建好的重组质粒sufBC-PET28a导入受体细胞X.受体细胞最好选择大肠杆菌(酵母菌或大肠杆菌). (5)筛选含有目的基因的受体细胞X扩大培养,并诱导其表达融合蛋白SufBC.将融合蛋白与固体基质相连,再加入SufD蛋白,混合摇匀,然后洗去未结合的SufD蛋白.最后将固体基质上的蛋白洗脱下来进行电泳,结果如图3所示,这...
1 可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是不是融解性太差，建议将你的氨基酸序列做个疏水性分析。如果确实如此的话可能要重新构载体
pet是T7启动子，BL21不含T7RNA聚合酶，所以不适于用BL21表达，应该是这个原因吧
1 可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。
然后选用新买的pET28a作为载体，设计引物，pcr扩增，跑胶验证都正确。pcr产物纯化（kit），酶切（目的...