数字 PCR(Digital PCR, dPCR) 是目前可用的另一种强大技术，在临床诊断中有着广泛的应用。其中，dPCR 方法用于液体活检中的癌症监测和器官移植排斥监测等应用，这两种方法都基于检测患者样本中低丰度的无细胞 DNA[13]。dPCR 技术的原理 (图 5) 涉及将具有制备的 PCR 溶液的样本分离成大量分区 (通常为纳升大小...
很多人误以为RT-PCR是Real-time PCR的缩写,因此将二者混为一谈,但实际上是不一样的,国际上的约定俗成的是:RT-PCR特指反转录PCR,而Real-time PCR一般缩写为qPCR(quantitative real-time PCR)(见前面的介绍)。 下面详细介绍反转录PCR (1)反转录PCR 反转录PCR(Reverse Transcription - PCR,RT-PCR),是PCR的一...
(1) 准备反应体系:模板 DNA 或经过逆转录得到的 cDNA、引物 (正、反向)、荧光染料 (如 SYBR Green) 或探针 (如Taqman 探针、qPCR 探针等)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反应缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、耐高温TaqDNA 聚合酶或专用的荧光 PCR 聚合酶、去离子水等。也可直接使用 qPCR Ki...
同样要经过多个扩增循环,其中模板 DNA 最初变性,然后是针对特定序列的寡核苷酸引物的退火,随后通过耐热 DNA 聚合酶从每个退火引物延伸互补链,导致扩增子数量在 PCR 期间呈指数增长,扩增子数量的增加是在 PCR 过程中通过荧光报告基因检测“实时”记录的。 基本步骤: (1) 准备反应体系:模板 DNA 或经过逆转录得到的 ...
也可直接使用RT-PCR Kit。 (2) 逆转录:设置逆转录程序。 (3) PCR 扩增:以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和两步法 RT-qPCR 两种)。 (4) 产物分析:通过琼脂糖凝胶电泳(RT-PCR)或荧光信号 (RT-qPCR)分析扩增效果。 此外,一种将 RT-PCR 与 qPCR 相结合的...
逆转录 PCR (RT-PCR) 逆转录 PCR(Reverse transcription PCR, RT-PCR) 可使用 RNA 作为模板生成互补 DNA (cDNA)。利用逆转录酶,产生 cDNA 的单链拷贝。然后,这可以通过 DNA 聚合酶扩增,产生双链 cDNA,进入基于 PCR 的标准扩增过程 (图 4A)。
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合,其中的“RT”是Reverse transcription(逆转录)的意思,所以RT-qPCR是结合了荧光定量技术的逆转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR...
也可直接使用 RT-PCR Kit。 (2) 逆转录:设置逆转录程序。 (3) PCR 扩增:以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和两步法 RT-qPCR 两种)。 (4) 产物分析:通过琼脂糖凝胶电泳 (RT-PCR) 或荧光信号 (RT-qPCR) 分析扩增效果。
实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT-PCR,RT-qPCR)是qPCR和RT-PCR的组合,所以RT-qPCR(也有人写成qRT-PCR)是结合了荧光定量技术的反转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析(RT-PCR只可以定性,但不能进行定量分析)。
RT-PCR与刚才介绍的PCR技术的主要区别在于它是从mRNA而不是双链DNA开始的。先利用反向引物在反转录酶催化下将mRNA反转录成单链DNA；DNA-RNA杂交链变性后，再用正向引物将单链DNA转换成双链DNA；接着在DNA聚合酶催化下，正向引物起始cDNA第二链合成，将单链DNA转换成双链DNA；最后用常规PCR技术扩增足量的cDNA用于...