一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。 二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引 物。...
在PCR反应中,Mg2 离子的作用是什么? 答案 A 解析 null 本题来源 题目:在PCR反应中,Mg2 离子的作用是什么? 来源: pcr上岗试题及答案 收藏 反馈 分享
1. 在一般的PCR反应中，当各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L。2. Mg2+浓度过高会导致非特异性扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性。PCR反应的这五个要素的选择和优化是PCR反应成功的关键。合理设计和选择引物，确保适当浓度和质量的酶、dNTP和模板DNA，以及适宜的Mg2+浓度，可以提高P...
能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端,合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性,没有校正功能。某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 (六)模板:PCR对模板DNA的纯度不要求很高,但应尽量不含...
常规PCR的特异性会随着模板复杂性增加而降低。模板复杂性越高,引物与预期靶序列以外的序列杂乱地结合的概率就越大。可以通过优化PCR各成分(如Mg2+、引物、dNTP及模板)的浓度减少错配的发生,也可以使用降落PCR提高反应特异性。 其原理是:在降落PCR中,退火温度的起始设置会比引物计算的Tm值高5-10℃,在较高的退火温...
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
(2)镁离子浓度:一般用量1.5~2.0mmolL,TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低,会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响底物的退火、模板与PCR产物的解链温度,从而影响小型化片段的产率。 (3)底物浓度:工作浓度20~200μmolL,dNTPs的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。浓度...
需要提醒的是MgCl2 , 有些公司提供的PCR缓冲液中已经含有适当浓度的MgCl2,此时无需在常规的PCR体系中另外添加;但是有些公司的PCR缓冲液中不含有Mg2+ 而是提供独立包装的MgCl2,以便使用者在设置PCR反应体系时,能够按照个性的实验设计要求来添加。 二、PCR体系优化: 1、Mg2+浓度: 镁离子(Mg2+)作为DNA聚合酶活性的...
而在PCR反应中,镁离子(Mg2+)的存在对于反应的进行起到了至关重要的作用。 镁离子对于DNA的稳定性和特异性起到了重要的调节作用。在PCR反应中,DNA的双链结构需要被解开,以便引物与模板DNA进行特异性的结合。而镁离子可以促使DNA的解旋,使得引物能够与模板DNA的特定区域配对。此外,镁离子还可以通过与DNA双链结合,...
镁离子(Mg2+)作为DNA聚合酶活性的辅助因子,有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键(图 8)。此外, Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷,从而促进引物与DNA模板形成复合物(图 8) 图8.DNA聚合酶活性位点处镁离子的作用。在DNA聚合期间,Mg2+ 可帮助...