由于使用了带有荧光标记的dNTP,在合成时荧光基团会发出亮光,通过检测亮光来读取碱基。该机器具有NGS所达不到的超长读长,同时由于是“自然”的链合成,异常GC区域对于其测序无影响。 Pacbio测序的HIFI READS: HiFi reads是使用PacBio Sequel系统之一上的circular consensus sequencing(CCS)模式生成的一种数据。高保真reads...
细菌16S全长约1.5Kb,PacBio测序平台最保守的Reads平均读长8-15kb,假设最短的一条Reads 8Kb,也可以满足一条1.5Kb的16S全长纠错5次,所以我们承诺:minPasses≥5,据官方数据,同一片段测序 4 次后,单一Read的准确性至少可达99%。 Pacbio SequelⅡ测序平台 PacBio SMRT测序原理 CCS Library(HiFi)测序原理 循环次数...
一、何为 HiFi测序 HiFi reads(High Fidelity reads)是2019年由PacBio推出的基于环化共有序列(Circular Consensus Sequencing,CCS)模式产生的既兼顾长读长(10-20kb的长度)又具有高精度(>99%准确率)的测序结果。 在CCS测序模式下(图1),酶读长远大于插入片段长度,聚合酶会绕着模板进行滚环测序,插入片段会被多次测序。
PacBio测序仪可以支持Subreads类型下机数据和HiFi类型下机数据。两者之间的区别是,HiFi数据是将同一个ZMW孔中相同分子多次测到的Subreads经过合并纠错后生成的,具有较高的准确性,这一步转换称为CCS过程。在实际项目中,建议和服务商要求提供HiFi数据,因为这一转换过程非常消耗CPU资源。在CCS过程中,软件是不会去除MAS-...
而PacBio HiFi测序凭借无偏好性的特点,应该更多的用于发现原核生物的多样性并产生更可靠和更丰富的MAG(metagenome-assembled genomes)信息。 部分数据展示 贝加尔湖PacBio宏基因组研究 作者使用 PacBio CCS 对夏季收集的深水样本(1600米)进行长读长宏基因组(LAGs)测序,以补充以前在夏季和冬季在1250和1350米深的...
生物具有遗传多样性,杂合的基因组区域可能为表型变异的主要贡献者,这种复杂性对基因组组装提出了挑战,而PacBio HiFi测序则是迎接这一挑战的重要利器。 大多数动植物具有复杂的基因组,具有体积大、杂合度高、多倍体等特点。生物具有遗传多样性,杂合的基因组区域可能为表型变异的主要贡献者,这种复杂性对基因组组装提出了...
在这种前提下，HiFi Reads对序列拼接准确性的保障就凸显出其价值。从PacBio官网公布的测试结果看（如下表），相比于二代测序平台及三代ONT平台，PacBio HiFi Reads进行全基因组范围内的变异检测的准确性更高，对SNV精确度和检出率可达99.9%，对插入缺失的精确度和检出率可达99.4%。（详见In precisionFDA Challenge...
三、HiFi测序的性能 1.使用HiFi Reads进行基因组De Novo组装的能力：利用HiFi reads应用FALCON、Canu和wtdbg2算法对HG002基因组进行从头组装，结果显示组装质量较高，contigN50超过15Mb，吻合率达到99.9983%。2.使用HiFi测序检测人类基因组变异的能力：PacBio HiFi数据在所有类别中提供了最高的准确性，...
HiFi测序的核心是高精度的CCS模式，酶读长远大于插入片段，通过多次测序和算法纠错，生成的HiFi reads能有效区分生物学变异和测序错误。构建HiFi测序所需的SMRTbell文库，如哑铃形状，包含发卡接头和DNA模板，经过一系列步骤，形成高质量的环状模板进行测序。HiFi测序在基因组组装和变异检测中表现出色。在HG002...