首先我们要设计引物,假设引物的序列为: A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3 A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来,我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1,我们会发现这两条...
其实就是PCR,做两次,把两段序列融合在一起,第一次PCR的时候,第一段序列的3'引物和第二段序列的5'引物要有一段互补区,然后用第一次PCR的产物做模板,第一段序列的5'引物和第二段序列的3'引物做引物,进行第二次扩增,形成融合序列,详见图示 追问: 请问在做OVERLAP的时候要注意什么吗我P出了两个目的条带 然...
当然,overlap区本身也有形成某种空间结构的可能(例如发夹结构),但这可以通过软件设计(如引物设计软件)来避免。 如果使用该技术还得不到全长片断,我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。TouchDown PCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度, 循环几周(如三周...
overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度 （一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循 环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的...
在设计引物时,先按照普通引物设计好,然后在引物2的5’端和引物3的5'端分别加上4-8个碱基(引物2所加的碱基应为产物B的5'端4-8个碱基序列;引物3所加的碱基应为产物A的3'端4-8个碱基序列)。第一轮PCR,先分别用引物1、引物2扩增出片段A;引物3、引物4扩增出片段B。分别割胶回收产物A和产物B,这样扩增...
你的设计有没有问题？重叠那段的引物是连接的关键，而这段引物一般比较长，Tm不会只有59。建议用不对称PCR做第一轮，分别P出2个单链为主的产物，这样纯化容易；然后用2端引物扩第二轮。这时的退火温度不是低，而是比较高，因为跨链。所以两端的引物也要符合这点要求，不能太短。
我的原则是引物最好控制在50以下，当然70的我也用过，但是容易在合成中出现错误，因此要在构建完成后测序验证，长度够用即可，不是越长越好。
常见原因如下:(1)引物没设计好,重叠的部分长度不够好;(2)过长片段的叠加通常都比较困难;(3)PCR体系不够好,导致扩增不好。00分享举报您可能感兴趣的内容广告 搬家公司收费价格表 查询跨市收费标准,超过这个数就亏了 搬家公司收费价格表就选易丰搬家,全国自营连锁公司,随叫随到,包搬包运,精细打包,多种车型,...