结合，且亲和力值 Kd 为 6.49 ±2.44 μM，而 GFP 蛋白不与 c-di-GMP 结合 (图4)。图4 MST 技术验证 NasT 特异性结合 c-di-GMP 此外，研究人员采用 微量热泳动(MST) 技术竞争结合分析实验 发现：NasT- GFP 融合蛋白能与 nirBD 操纵子前导 RNA (NalA) 结合，亲和力 Kd 值为0.27 ± 0.12 μ...
MST 微量热泳动实验中,作者将含ASIC1a -GFP 质粒转染HEK293T 细胞中,将细胞进行裂解,离心后取裂解液上清。以 ASIC1a-GFP 融合蛋白作为荧光信号分子(Target 分子),直接利用细胞裂解上清液进行免纯化微量热泳动 (MST)检测。结果表明:在pH6.8和pH7.0条件下,谷氨酸与hASIC1a-GFP(人的膜蛋白)的亲和力分别为 113.3...
以Dlat-GFP 融合蛋白作为荧光信号分子(Target 分子),直接利用细胞裂解上清液进行免纯化微量热泳动 (MST)检测,结果显示:HPF 与 Dlat-GFP 结合能力较强,亲和力为578nM (注:GFP 与 HPF 为银杏对照组,GFP 不与 HFP 结合)(图2A)。分子对接和分子动力学模拟结果显示:HPF与Dlat 蛋白的 C 端内部域有良好的形状匹配...
技术发现蟾毒灵能与 ZFP91 发生相互作用，实验时，作者将 pEGFP-N1-ZFP91 质粒瞬染至 HEK 293T 细胞中，进行培养一段时间后，用 NP40 buffer 对细胞进行裂解，离心后取上清，以含有 GFP 的融合蛋白作为 Target 分子，将上清液与蟾毒灵共孵育后上样检测，测得蟾毒灵 (bufalin) 与 ZFP91 的亲和力 Kd 为462...
作者通过 MST 实验验证了抗抑郁药氟西汀(FLX)和在 HEK293T 细胞裂解液中用 GFP 标记的 TRKB 可以直接结合(图 5),并通过分子建模进一步证明了这种抗抑郁药可以与 TrkB 二聚体结合,增加了它们在突触细胞膜(富含胆固醇的膜区)中的数量,最终增强 BDNF 的信号传导。
进行 MST 实验需对重组表达纯化的蛋白进行荧光标记以制备 Target 分子。但是有些蛋白很难进行分离纯化，导致无法进行体外分子互作实验。利用 MST 免纯化技术，对于难以纯化的蛋白可以构建其 GFP 融合蛋白，制备细胞裂解液直接进行 MST 实验。MST 免纯化技术原理如下图所示。图2 MST免纯化实验示意图 案例一 MST 在膀胱...
而MST 微量热泳动技术可以采用免纯化方法(以农杆菌介导的瞬时表达技术为例),将目的蛋白与 GFP 或者 YFP 融合表达,通过农杆菌介导的烟草瞬时表达技术,在烟草叶片上表达目的蛋白,提取烟草叶片总蛋白进行MST实验,从而可以在不需要纯化目标蛋白的情况下完成分子互作检测。
将其中一个互作分子(大多是蛋白)标记荧光染料或者融合GFP标签,将标记蛋白和配体分子按照特定的浓度梯度置于毛细管中,红外激光加热产生一个微观的温度梯度场发生热泳动,其水化层、分子大小、电荷等分子性质会随着热泳动发生改变,进而引起反应体系中荧光分布的变化。MST除了能精确检测生物分子间相互作用,通过计算解离常数(...
为进一步验证 TRAF2 与 β-catenin 之间的结合，研究者利用微量热泳动（MST）技术测定了 GFP-TRAF2 过表达的 293T 细胞裂解液与 β-catenin 的亲和力，结果表明其平衡解离常数为8.41 μM（图6A）。此外，在存在 LDA 的情况下，MST 检测显示 GFP-TRAF2 失去了与 β-catenin 的结合能力（图6B），这表明 ...
但是,利用免纯化微量热泳动(Microscale Thermophoresis, MST)技术,对于难以纯化的蛋白可以构建 GFP 等荧光融合蛋白,采用细胞裂解液直接进行 MST 实验,从而检测蛋白与分子间相互作用。如图1所示: 图1 MST 技术-蛋白免纯化互作亲和力检测 此外,蛋白在纯化过程中其构象可能发生改变,所获得的药物-靶标相互作用信息不能...