加尾法逆转录产物的5’端均为通用序列,因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R,加尾法逆转录试剂盒里附带)。不同的是根据miRNA序列设计的正向引物,其特异性非常重要。对于内参基因,通常试剂盒里附带内参基因U6的正向引物,使用该引物与通用引物R即可进行内参基因U6的扩增。 miRNA加尾法逆转录试剂盒组分,红线框住部分...
加尾法的qPCR反应体系跟普通的qPCR体系一样,程序也类似。但是如果一次做许多的miRNA,在一次qPCR反应后可以观察熔解曲线看该引物特异性是否较好,也可通过优化下退火温度,改善正向引物。 三、经验分享 (1)茎环法:对于每个miRNA都会设计特异的逆转录引物并进行单个miRNA的单独逆转录;另外,也会设计特异的qPCR特异正向引物。
加尾法逆转录引物：3'端存在1-2个锚定碱基的Oligo dT（miRNA加尾法逆转录试剂盒自带），锚定碱基可特异性地结合到miRNA上，从而让逆转录引物结合到紧挨着miRNA的那段PolyA序列上。加尾法qPCR检测引物：miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法的逆转录产物5'端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相...
加尾法的qPCR反应体系跟普通的qPCR体系一样,程序也类似。但是如果一次做许多的miRNA,在一次qPCR反应后可以观察熔解曲线看该引物特异性是否较好,也可通过优化下退火温度,改善正向引物。 三、经验分享 (1)茎环法:对于每个miRNA都会设计特异的逆转录引物并进行单个miRNA的单独逆转录;另外,也会设计特异的qPCR特异正向引物。
2. miRNA加尾法逆转录+通用荧光定量PCR ①逆转录(RT): 将提取的RNA按照试剂盒的体系配置好,该步骤我们只需提供RNA,其余逆转录引物、逆转录酶以及dNTPs包含在Mix中。一管内即可逆转录多个miRNA的cDNA。 ②荧光定量(qPCR):使用通用荧光定量试剂盒 加尾法的上游引物(正向引物)设计: ...
这两条引物在qPCR中的反应过程如下所示: 2、加尾法 以mmu-miR-30d-5p为例对加尾法进行说明,其实它也可以是miR-770-5p,也可以是miR-21-3p等,一次反转录几乎能够把细胞内的所有miRNA都给反转录成cDNA。因此,如果批量对miRNA进行qPCR筛选的话,加尾法是一种比较合适的方法,它只需要设计针对某个miRNA的特异引物...
microRNA(后方简称miRNA)的长度比较短,通常是20nt到24nt长度,因此用常规的qPCR法很难对其直接定量。现在常用的对miRNA的定量方法主要有三种,分别为加尾法,茎环引物法,探针法。这篇笔记主要以mmu-miR-30d-50为例总结一下这前两种方法,因为探针法的原理与实验步骤我以前总结过。就我自己的看法,这三种方法最根本的...
microRNA(后方简称miRNA)的长度比较短,通常是20nt到24nt长度,因此用常规的qPCR法很难对其直接定量。现在常用的对miRNA的定量方法主要有三种,分别为加尾法,茎环引物法,探针法。这篇笔记主要以mmu-miR-30d-50为例总结一下这前两种方法,因为探针法的原理与实验步骤我以前总结过。就我自己的看法,这三种方法最根本的...
PolyA加尾法逆转录的miRNA的qPCR引物设计,非常简单。 因为采用PolyA加尾法逆转录miRNA产生的cDNA,miRNA的本身序列就是qPCR引物,严格的说,把miRNA本身序列的U变为T就是qPCR的正向引物,反向引物都由试剂盒提供,不需要自己准备。 为什么呢? 看完PolyA加尾法逆转录miRNA,你就明白了。
qPCR miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似,但由于加尾法逆转录产物的5端均为通用序列,因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R),不同的是根据miRNA序列设计的正向引物。正向引物的特异性就变得非常重要。对于内参,生工生物的miRNA加尾法第一链cDNA合成试剂盒(B532451)中内置了内参U6的正向引物,使用该引物与通用...