1)MeRIP-qPCR的目的 与普通的qPCR有所不同,MeRIP-qPCR是验证某个目标基因上的某个修饰位点(以一小段区域的形式,MeRIP法精确不到单碱基)的修饰水平。得到的结果往往是一个%(IP/Input)的数值,它体现的是该位点的修饰水平(目标基因发生该修饰的转录本占该基因总转录本的比例),而普通qPCR验证的是某个基因的表达...
还有对应的试剂盒可以使用,其核心原理与ELISA反应类似,经过优化后检测m6A灵敏度也高。 还有一项必备的验证试验用来验证甲基化相关酶与关键基因结合:所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。这种技术可以做到对发生甲基化的RNA进...
MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR的另一种说法。所以从名称上我们就能发现,m6A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前,我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。 关于RT-qPCR的方法学论文很多,所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因,所以暂且我们先来看看相对...
技术原理:RIP(RNA结合蛋白免疫沉淀)是研究细胞内蛋白与RNA结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析,结合的RNA可以通过高通量测序(RIP-seq)或定量PCR(RIP-qPCR)方法来鉴定。RIP...
那么我们首先依旧是与传统的RT-qPCR相似,用相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰,以保证引物特异性扩增。然后就是校准每一个样本的平均Ct值,以消除样本准备过程中的差异。 接下来我们就要开始对每个样本中,RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值,再对3个生物学重复样本中的Ct平均值再去计算其Ct平...
MeRIP-qPCR：靶向特定区域进行m6A修饰测定，比较准确。需要全甲基化和全不甲基化的标准品加入。技术特点...
一、m6A位点鉴定方法。 1. 高通量测序技术。 这可是目前鉴定m6A位点的一个超厉害的方法哟!就像给基因做一个超级详细的“体检”。其中比较常用的是MeRIP-seq,它的原理就是用抗m6A抗体把含有m6A修饰的RNA片段富集起来,然后进行高通量测序。通过对测序数据的分析,就能找到那些可能存在m6A修饰的位点啦。不过呢,这个方法...
RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等)。RIP实验结束后富集到的RNA,既可以直接用于qPCR,也可用于芯片和测序...
Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-Seq, 也称作m6A-Seq),该方法是基于特异性抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理,以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础,然后通过高通量测序,在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域。MeRIP-seq技术为研究m6A修饰在RNA生物学和疾病中的作用提供了一个强大的...