用质谱平台检测ADC中的总抗体和结合型载荷,拓展了临床前的样品检测能力。在没有对应的抗载荷抗体的情况下,ELISA方法不能用于检测结合型抗体的检测。但采用免疫富集后经过酶水解的样品,LC-MS/MS质谱可以精准检测特征性肽段和小分子载荷,从而可以实现结合型载荷和总抗体的检测, 减少对于特定抗体和试剂的要求,并可以同时...
03 LC-MS/MS:一份样品完成ADC药物的全组分分析 随着LC-MS/MS方法检测抗体等蛋白物质的技术逐渐成熟,也因其具有良好特异性,在ADC药物的生物分析中除了将其应用于游离小分子细胞毒素和偶联在抗体上的小分子细胞毒素的定量分析,还能在合适的免疫捕获及酶解处理后,通过特征肽段对抗体部分进行定量分析。这就意味着,我们...
基于配体结合分析(LBA,Ligand binding assay)和液相色谱-串联质谱检测(LC-MS/MS, Liquid chromatography-tandem mass spectrometry)的生物分析方法已被用于分析各种ADC分析物[9,11]。其中LBA的分析方法通常用于检测总抗体、偶联抗体,LC-...
图1:Ⓐ使用HR-MS平台进行ADC药物DAR(Drug-to-Antibody Ratio,药物-抗体偶联比)的测定;Ⓑ使用抗毒素抗体配体结合法检测ADC药物浓度(偶联抗体浓度);Ⓒ使用免疫富集+液质联用平台测定抗体偶联毒素浓度;Ⓓ使用配体结合法或者液质联用平台测定总抗浓度 ;Ⓔ一般不检测裸抗;Ⓕ使用LC-MS平台检测毒素小分子化合物。
通过肽图水平的LC-MS/MS分析,也可以实现对于副反应位点的鉴别和检测,从而保证ADC药物的安全有效。图7展示了基于半胱氨酸偶联的ADC分子,发生在赖氨酸-NH2的副反应图谱,通过二级质谱数据中肽段序列b、y离子及偶联小分子MMAE特征碎片, 确认了副反应的发生及位点。
抗体偶联药物(ADC)将细胞毒性药物的效力与单克隆抗体(mAb)的高抗原特异性结合,其中DAR(抗体药物偶联比)是ADC药物的一个重要质量参数,影响药物安全性和有效性。疏水相互作用色谱(HIC)、反相高效色谱(RPLC)、高分辨质谱(HRMS)已被证明是测定ADC药物DAR值的有效方法,然而这些方法均有一定的局限性。随着多维LC/MS方法...
相比于2D-LC方法,4D- LC/MS (SEC-还原-胰蛋白酶消化- RPHPLC)方法可同时测定单体、二聚体及多聚体的DAR值,该方法先通过一维UHP-SEC分离ADC药物,然后经过在线还原和消化,进而利用反相色谱测定DAR值,同时可以得到氧化和脱酰胺等翻译后修饰的信息。 总体而言,与标准的离线分析方法相比,多维LC/MS提供了一种简化的...
第一步是亲和免疫捕获,借助对ADC抗体部分具有特异性结合的抗体或抗原对目标总抗进行纯化; 第二步是酶解,生成抗体的特征多肽; 最后利用LC-MS/MS进行检测定量。 细心的读者可能已经发现,总抗体的测定与DAR值分析的第一步处理基本一致,实际上唯一的区别在于使用LC-MS/MS平台测定总抗时,由于对捕获试剂的特异性要求下降...
游离细胞毒素的检测是通过蛋白沉淀,液液萃取或固相萃取等小分子生物分析常用的前处理方法提取细胞毒素后直接进行LC-MS/MS的检测。 图2: ADC生物分析的常用策略 但当面临特异性试剂制备周期过长或者试剂的特异性、亲和力不满足测试需求时,LC-MS/MS平台则能够提供一个速度快、成本低、一份样品分析ADC全部检测组分的...
有一种情况是,对于待检测的随机偶联ADC,使用抗小分子化药毒物捕获试剂开发的偶联抗体配体结合法对DAR敏感;相比之下,使用小柱检测抗小分子化药毒物捕获的偶联抗体LC-MS分析证明对DAR不敏感(Wang等人,2016年),但原因不明。然而,LC-MS/MS检测偶联抗体尚未广泛应用(与LBA相比),除非有特殊需要,例如区分不同类型的偶联...