在检测cccDNA过程中,如何从肝组织中特异性提取cccDNA是非常重要的一步,鉴于rcDNA与cccDNA具有序列同源性,cccDNA的整段链信息同样体现在rcDNA链上,且其丰度比cccDNA要高的多,跨缺口PCR难以完全区分cccDNA和rcDNA,如何避免rcDNA污染是准确检测的前提条件,是cccDNA检测中最关...
考虑到该研究中作者的富集细胞核DNA步骤，这可能是最早提示rcDNA和dslDNA可以在感染细胞胞核富集的证据。尽管作者仅是通过分别将L-、M-和S-HBs的翻译起始密码子（ATG）突变使之分别不表达，并利用Sourthern blot显示cccDNA量，然而作者在讨论中却声称“至少在我们的系统中，各种形式的HBV表面蛋白对细胞内来源的cccDNA...
三、检测方法(1)hbvcccdna的富集提取:①获得待测样本:取200μl血清样本,放入离心管中,向离心管中加入300μl裂解液、20μl蛋白酶k和20μl磁珠,涡旋混匀后置于50～60℃振荡孵育15分钟,即得到待测样本;所述的裂解液包括:异硫氰酸胍2m、ph8.0的tris10mm、ph8.0的edta10mm、tritonx-1001%(v/v)和sds1%(w/v),...
此外,感染HBV的细胞中还有较多的rcDNA、双链DNA和单链DNA等,分离所有DNA(包括病毒DNA和染色体DNA)需要裂解细胞核释放总DNA,并去除蛋白质。比较常用的cccDNA提取方法有Hirt提取和试剂盒提取,前者步骤较为复杂却是经典的方法;后者操作更为简单。 常规的cccDNA检测主...
基于cccDNA和rcDNA结构的差异,可通过跨正负链缺口设计引物探针特异性扩增cccDNA,或在cccDNA提取过程中通过核酸酶处理样本中的非cccDNA,以减少非特异性污染。例如检测样本经质粒安全ATP依赖DNA酶(PSAD)、核酸外切酶Ⅰ&Ⅲ、T5核酸外切酶等预处理以消化包括rcDNA等非共价闭合环状形式的所有核酸形式,起到相对纯化cccDNA模板的...
不止于此,作者还推导了相较于经典的染色体DNA半保留复制,逆转录形成cccDNA的过程可能更为合理,并强调了这种cccDNA的扩增形式使得cccDNA无需(走严格受宿主细胞周期调控的)半保守复制,也不需要多轮感染。而关于HBV是一种逆转录病毒的最早推测是在1987年6月10日。当时Jesse Summers在美国国立卫生研究院Jack Masur大礼堂...
此外,对Hirt提取的AAV-HBV 1.04载体转导样本进行T5核酸外切酶和SacⅡ处理并进行测序,证实了完整的HBV cccDNA(图6A,B)。为进一步研究该模型中产生的HBV cccDNA是否能类似于天然HBV感染形成的cccDNA,研究人员评估了cccDNA与几种已知的cccDNA结合蛋白之间的关联性。染色质免疫沉淀(ChIP)分析显示,组蛋白H3、HBc和聚合酶Ⅱ...
乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状 DNA(covalently closed circμLar DNA,cccDNA)是乙肝病毒前基因组 RNA 复制的原始模板,虽含量较少,每个肝细胞内只有约 5～50 个拷贝,但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义,只有清除了 cccDNA,才能*消除乙肝患者病毒携带状态。为此乙型肝炎病毒ccc DNA(HBV-cccDNA)...
目前,针对HBV cccDNA检测的新方法有qPCR、磁珠杂交捕获法、RCA结合IS-PCR和数字PCR等。qPCR包括数字PCR等主要借助和引物跨缺口设计和酶处理来特异性检测HBV cccDNA;磁珠杂交捕获主要优势是特异性提取捕获HBV cccDNA;RCA结合IS-PCR提高了检测HBV cccDNA的特异度;单细胞的HBV ...