步骤4:由于GST标签蛋白与谷胱甘肽磁珠的结合特异性,所以仅带有GST标签的目标蛋白会与磁珠结合,而不会与其它蛋白质结合。 步骤5:对细胞裂解液施加磁力,使GST标签蛋白与谷胱甘肽珠结合,而不会含有其它蛋白质。 步骤6:去除未结合的细胞裂解液/蛋白质上清, 带有GST标签的目标蛋白现已被纯化。 图6:使用磁珠纯化带有GST标...
去除沉淀物或者变性蛋白:用 6 M盐酸脓洗2个柱体积后,紧接着用pH 7.3的PBS洗5个柱体积;b. 去除疏水性的化合物:用 70%乙醇洗34个柱体积或者用1% Triton? X -100洗2个柱体积后,紧接着用 pH 7.3的PBS洗5个柱体积。5. 最好用新鲜纯化的蛋白用于后续实验,根据实际情况选用蛋白定量试剂盒;6. 上述注意事项...
GST纯化系统是利用GST(glutathione-S-transferase)融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过二硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。该纯化柱中,凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽疏基转移酶(即GST-tag(26KD))之间酶和底物的特异性作用力,使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂...
可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白。与传统柱层析方法相比,磁珠纯化法极大地简化纯化工艺和提高纯化效率。适合科研和工业领域快速便捷地进行His和GST标签蛋白的纯化。 原理 图1. Ni-NTA 琼脂糖磁珠纯化His tag蛋白原理 图2. GST-tag蛋白纯化磁珠纯化原理 产品应用 His和GST融合蛋白的纯化...
蛋白质表达：带GST标签蛋白的纯化
11.重复步骤9和10两次; 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱,也可用凝血酶,肠激酶或Xa因子切割,释放靶蛋白。 用谷胱甘肽洗脱融合蛋白: a. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液,室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白; b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; ...
1、His-Tag组氨酸的残基上带有1个咪唑基团,可与多种金属离子发生特殊的相互作用,如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,再用咪唑竞争洗脱,达到分离纯化的效果。 2、Ni2+有六个螯合价位,被含有3,4或5个电子供体基团的螯合物固定在吸附剂上;所以IDA与His标签蛋白结合的能力相对更强,特异性较弱,而TED则相反。
His-Tag(组氨酸标签)His-Tag 由6-10 个组氨酸残基组成,分子量不到0.84KD,通常插入在目的蛋白的C 末端或N 末端。His-Tag是目前原核表达最常用的标签,蛋白纯化完之后可以不需切除此标签,也不会对蛋白产生功能影响。同时,蛋白纯化步骤简便,纯化条件温和,对蛋白也不会产生太大影响。His-Tag是蛋白纯化的首选标签。
01-GST标签蛋白结合效率低或不结合 可能原因 解决方法 蛋白序列出现移码等错误 测序确认,调整阅读框以获得GST-Tag融合表达蛋白;选择适宜的宿主菌,如蛋白酶缺陷型大肠杆菌,稀有密码子宿主菌Rosetta系列。 GST融合蛋白被机械裂解的方法变性(比如超声) 过度超声产热会使标签蛋白变性,建议采用如超高压破碎等温和的机械裂解方...
GST Tag 抗体的制备: GST Tag 抗体的制备通常包括以下步骤: 抗原制备:GST Tag 抗体的抗原通常是纯化的GST蛋白或包含GST标签的融合蛋白。 动物免疫:将GST Tag 抗原注射到小鼠、兔子或其他动物中,以激发它们的免疫系统产生GST Tag 特异性抗体。 血清采集:采集免疫动物的血清样本,其中包含了GST Tag 特异性抗体。