5、GST pull-down 实验流程 ①蛋白的抽提与纯化:原核表达蛋白分离纯化。 在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B,4℃摇床上缓慢摇动30~60min; 4℃,4000rpm离心5min,弃去上清; 加入200ul预冷的PBS溶液,轻晃悬浮珠子,洗涤一次,4℃,4000rpm离心5min,弃去上清,重复此步骤3次; 吸走珠子表面的液体,但...
GSTPulldown实验流程 一、实验准备阶段 1.确定实验目的 (1)确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题 (2)定义所需的实验指标和结果参数 2.准备实验材料 (1)准备所需的细胞或组织样本 (2)提取或购买GST标记的蛋白 二、样品处理与制备 1.细胞处理 (1)处理细胞以获得所需的细胞提取物 (2)对细胞提取物进行蛋白...
2.4℃,4000 rpm离心5 min,弃去上清,该Sepharose上结合了GST-a融合蛋白; 3.加入200 μl预冷的PBS溶液,轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤一次,4℃,4000 rpm离心5 min,弃去上清,重复此步骤3次; 4.最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体,但注意不要吸走珠子,即可获得结合GST-a的Sepharose。 三、b蛋白的制备 b蛋白可...
DNA pull-down实验首先针对靶标区域设计特异性DNA探针,探针经过脱硫生物素标记,跟偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞核提取物与磁珠-DNA探针孵育,作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合;纯化出与靶DNA片段结合的蛋白复合体,经过洗涤可...
四、半pull down实验 1、分配好zeta-GST到EP管中,其蛋白量与GST-beads上的GST蛋白量一致 10ul zeta-GST-beads(beads:PBS=1:1)即=5ul GST-beads 取50ul zeta-GST-beads(beads:PBS=1:1) 5ul GST-beads用GST-beads空补剂 2、4度4h 3、IP Lysis buffer洗©...
本文将介绍GST pulldown实验的详细步骤,包括蛋白表达、亲和层析、洗涤、洗脱和分析等方面。 (附GST pulldollwn结构图) GST标签蛋白的表达 首先需要在目标蛋白上克隆GST标签,以便后续实验中使用。可以通过PCR扩增、限制性内切酶消化和连接、质粒转染等方法将GST标签与目标蛋白融合。融合蛋白的表达可以使用大肠杆菌等表达宿...
GST-PullDown步骤 GST-Pull Down 周一 早上：带有GST标签的ML-6P-1、GFP-6P-1保存菌划板（AMP+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。周二 早上：带有His标签的s9-28a、S8-28a保存菌划板（kana+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。早上：1.吸1ml过夜菌（ML、GFP）加入100ml培养基中，37℃，220rpm摇至OD=0.8左右...
GST pull-down实验原理与步骤 在GST pull-down实验中,利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签蛋白作为“捕获分子”,借助GST与其结合配体的亲和力,选择性地捕捉与目标蛋白质相互作用的分子。其基本步骤如下: 重组表达GST融合蛋白:首先,将GST基因与目标蛋白基因融合,构建含有GST标签和目标蛋白的重组DNA,使得表达的融合蛋白同时具...
实验步骤：① 获得带有 GST 标签的融合蛋白；② 将带有 GST 标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上；③ 获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白；④ 与融合蛋白发生相互作用的蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上；⑤ 切掉标签，洗脱得到相互作用的蛋白。影响GST pull down实验结果的因素 1、 载体选择 对于不同的实验需要构建...
GST pulldown实验原理 GST pull-down 是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。 目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹 (...