GST-Pull down 是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一,其原理是目的蛋白与GST融合表达,蛋白固定在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支持物,起到“诱饵蛋白”的作用。 目标蛋白溶液通过柱子,从…
GSTPulldown实验流程 一、实验准备阶段 1.确定实验目的 (1)确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题 (2)定义所需的实验指标和结果参数 2.准备实验材料 (1)准备所需的细胞或组织样本 (2)提取或购买GST标记的蛋白 二、样品处理与制备 1.细胞处理 (1)处理细胞以获得所需的细胞提取物 (2)对细胞提取物进行蛋白...
四、GST pull-down实验操作步骤分析图1.构建诱饵蛋白表达载体、蛋白表达和磁珠结合 2. 将磁珠结合的诱饵蛋白与总蛋白pull-down 3. WB验证 五、GST pull-down 与 Co-IP 区别及优缺点 GST pull-down 是两种蛋白在试管内(细胞以外)发生生化反应互作的结果,只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可,验证蛋白之间...
四、半pull down实验 1、分配好zeta-GST到EP管中,其蛋白量与GST-beads上的GST蛋白量一致 10ul zeta-GST-beads(beads:PBS=1:1)即=5ul GST-beads 取50ul zeta-GST-beads(beads:PBS=1:1) 5ul GST-beads用GST-beads空补剂 2、4度4h 3、IP Lysis buffer洗©...
本文将介绍GST pulldown实验的详细步骤,包括蛋白表达、亲和层析、洗涤、洗脱和分析等方面。 (附GST pulldollwn结构图) GST标签蛋白的表达 首先需要在目标蛋白上克隆GST标签,以便后续实验中使用。可以通过PCR扩增、限制性内切酶消化和连接、质粒转染等方法将GST标签与目标蛋白融合。融合蛋白的表达可以使用大肠杆菌等表达宿...
GST-PullDown步骤 GST-Pull Down 周一 早上：带有GST标签的ML-6P-1、GFP-6P-1保存菌划板（AMP+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。周二 早上：带有His标签的s9-28a、S8-28a保存菌划板（kana+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。早上：1.吸1ml过夜菌（ML、GFP）加入100ml培养基中，37℃，220rpm摇至OD=0.8左右...
一、实验目的:构建GST-P53融合表达载体,并过表达此蛋白。通过GST-pull down沉淀细胞中与P53蛋白互作的其他蛋白,并通过WB鉴定P53与HSP70是否互作。 二、实验材料 l主要试剂 l主要仪器及器材 三、实验方法 1、捕获蛋白制备 1)收集的细胞中加入1mL预冷的PBS;吹打混匀后,1500g 离心 5 min,去除上清,再重复洗涤细胞...
GST pull-down实验原理与步骤 在GST pull-down实验中,利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签蛋白作为“捕获分子”,借助GST与其结合配体的亲和力,选择性地捕捉与目标蛋白质相互作用的分子。其基本步骤如下: 重组表达GST融合蛋白:首先,将GST基因与目标蛋白基因融合,构建含有GST标签和目标蛋白的重组DNA,使得表达的融合蛋白同时具...
实验过程 GST-pull down 主要包括以下 3 部分：①利用基因重组技术构建带有 GST 标签的原核表②通过原核表达系统表达带有 GST 标签的融合蛋白；③利用 GST 亲和纯化柱进行蛋白纯化，获得高纯度的融合蛋白；再利用 GST 亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。实验结果 实验组GST-pull down第三列的实验结果可以看出KU-...
GST Pull down实验方法如下: 一、GST-a融合蛋白的表达 1.将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中; 2.挑取单克隆到含有5 ml LB培养基(加入5 μl氨苄)的10 ml试管里,37℃恒温振荡培养箱中培养过夜; 3.将培养菌液转移到含有500 ml LB(含500 μl氨苄)的1L锥形瓶中,37℃,200 rpm培养数小时; ...